[發明專利]一種鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法

在審

• 申請號: 201610094141.3
• 申請日: 2016-02-21
• 公開（公告）號: CN105648112A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 楊亞偉;張大林
• 申請（專利權）人: 楊亞偉
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法。

背景技術

對于病毒基因組測序，特別是RNA病毒的基因組測序，目前比較成熟，應用廣泛的方法 是設計擴增不同序列區域的引物，分段擴增并克隆到載體上，使用載體通用引物或特異性引 物進行序列測定。最后結合5’/3’RACE技術，得到5’/3’兩端的序列，將所有測序的序列拼接， 而獲得病毒全基因組序列。

目前該方法在鴨甲型肝炎病毒(DHAV)的全基因組序列測定也得到廣泛應用，但鴨甲 型肝炎病毒分為好多不同的基因型，比如基因1型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-1)、基因2型鴨 甲型肝炎病毒(DHAV-2)、基因3型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-3)等，按常規的策略，按每一 種基因型設計合成一套測序引物和5’/3’RACE引物，就需要3套，假如某些位點發生變異， 有可能導致測序失敗，另外對于未知基因型鴨甲型肝炎病毒，還需要先進行鑒定，比較麻煩。

發明內容

本發明目的在于提供一種新的簡便的鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法。本發明 設計了一套通用測序引物，通過用同一套引物就可以對不同基因型鴨甲型肝炎病毒DHAV-1、 DHAV-2及DHAV-3進行全基因測序列，即降低了分段克隆的勞動量，又節省了測序時間與 成本。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法，包括如下步驟：

(1)提取DHAVRNA，并通過反轉錄制備DHAVcDNA。

(2)DHAV基因組5’端和3’端的擴增：使用5’RACE試劑盒、引物5gps1out和5gps1in 按照試劑盒說明套式PCR擴增DHAV基因組5’端；使用3’RACE試劑盒、引物3GPS1-out 和3GPS1-in按照試劑盒說明套式PCR擴增DHAV基因組3’端，將擴增的DHAV基因組5’ 端和3’端進行膠回收純化備用。

(3)DHAV基因組大片段的擴增：以DHAVcDNA為模板，分別使用引物對DHV3897A-F、 DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R進行PCR擴增，分別得到3897bp和4867bp 左右產物，將兩擴增產物進行膠回收純化備用。

(4)將步驟(2)的擴增產物分別與T載體連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，轉化成功 的菌株送測序公司進行測序，測序引物為T載體測序引物。

將步驟(3)的擴增產物分別與T載體連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，轉化成功的菌株 送測序公司分別以引物對F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和 F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F、F8-R作為測序引物進行測序。

(5)以已知的DHAV全基因組序列為參考，將各測序片段進行組裝。

上述各引物序列如下：

5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；

5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；

3GPS1-out：TGTGTTGGMTATGACATC；

3GPS1-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；

DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，

DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；

DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，

DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；