[發(fā)明專利]一種鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610094141.3
• 申請日: 2016-02-21
• 公開（公告）號: CN105648112A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊亞偉;張大林
• 申請（專利權(quán)）人: 楊亞偉
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)提取鴨甲型肝炎病毒RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄制備鴨甲型肝炎病毒cDNA；

(2)鴨甲型肝炎病毒基因組5’端和3’端的擴(kuò)增：使用5’RACE試劑盒、引物5gps1out和 5gps1in按照試劑盒說明套式PCR擴(kuò)增DHAV基因組5’端；使用3’RACE試劑盒、引物 3GPS1-out和3GPS1-in按照試劑盒說明套式PCR擴(kuò)增DHAV基因組3’端，將擴(kuò)增的鴨甲型 肝炎病毒基因組5’端和3’端進(jìn)行膠回收純化備用；

(3)鴨甲型肝炎病毒基因組大片段的擴(kuò)增：以DHAVcDNA為模板，分別使用引物對 DHV3897A-F、DHV3897A-R和DHV4867B-F、DHV4867B-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將兩擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行膠回收純化備用；

(4)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成功 的菌株送測序公司進(jìn)行測序，測序引物為T載體測序引物；

將步驟(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成功的菌株 送測序公司分別以引物對F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和 F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F、F8-R作為測序引物進(jìn)行測序；

(5)以已知的鴨甲型肝炎病毒全基因組序列為參考，將各測序片段進(jìn)行組裝；

上述各引物序列如下：

5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；

5gps1in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；

3GPS1-out：TGTGTTGGMTATGACATC；

3GPS1-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；

DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG，

DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；

DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG，

DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；

F1-F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA，

F1-R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；

F2-F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG，

F2-R：TCTCCATAGCTRACRACATA；

F3-F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG，

F3-R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；

F4-F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG，

F4-R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；

F5-F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT，

F5-R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；

F6-F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT，

F6-R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；

F7-F：CCCTATGCCATCTTGGATCT，

F7-R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；

F8-F：CCAAACCCCTTAATTCAACG，

F8-R：ATCAACAGTRTTRGAGGTTCC；

引物序列中，W代表堿基G或T，M代表堿基A或C，Y代表堿基C或T，R代表堿基 A或G，K代表堿基G或T，S代表堿基G或C。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲型肝炎病毒基因組序列通用測序方法，其特征在于：所述 的鴨甲型肝炎病毒包括DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3。