[發(fā)明專(zhuān)利]一種高效快速抑制結(jié)縷草內(nèi)源基因表達(dá)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610092484.6
• 申請(qǐng)日: 2016-02-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105695505B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張兵;劉建秀;史經(jīng)昂;郭海林;宗俊勤;陳靜波;李丹丹;李建建;汪毅;郭愛(ài)桂
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/84
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種高效快速抑制結(jié)縷草內(nèi)源基因表達(dá)的方法。結(jié)縷草的遺傳轉(zhuǎn)化極為困難，嚴(yán)重制約了其基因功能研究和分子育種工作的開(kāi)展。本發(fā)明公開(kāi)的新方法利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻東格魯桿狀病毒基因沉默載體特異性地下調(diào)結(jié)縷草內(nèi)源基因的表達(dá)，為研究結(jié)縷草的基因功能提供了高效快捷的技術(shù)手段。所述方法包括以下步驟：1）結(jié)縷草目的基因片段的克隆；2）病毒誘導(dǎo)基因沉默載體的構(gòu)建；3）農(nóng)桿菌浸染結(jié)縷草植株；4）基因表達(dá)豐度的分子檢測(cè)。使用本方法可以成功使結(jié)縷草內(nèi)源基因的表達(dá)降低30%以上。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)用于高效快速抑制結(jié)縷草內(nèi)源基因表達(dá)的方法，屬于基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

結(jié)縷草（Zoysia japonicaL.）是禾本科畫(huà)眉草亞科結(jié)縷草屬的多年生植物，是世界公認(rèn)的優(yōu)良暖季型草坪草，具有廣泛的土壤適應(yīng)性、較強(qiáng)的抗性（抗寒性、抗旱性、耐鹽性、抗病蟲(chóng)害等）和耐粗放管理、省水節(jié)肥等優(yōu)良特性，被廣泛用于暖溫帶和亞熱帶的公園綠化、高爾夫球場(chǎng)和體育場(chǎng)等各種草坪的建設(shè)，在草坪產(chǎn)業(yè)中具有十分重要的地位。

對(duì)結(jié)縷草抗逆、發(fā)育相關(guān)重要基因進(jìn)行功能研究能夠?yàn)榛蚬こ逃N和分子輔助育種提供重要的候選基因和理論依據(jù)。然而目前所建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化方法步驟繁瑣且效率低下，嚴(yán)重阻礙了在結(jié)縷草植物體內(nèi)進(jìn)行目的基因功能的驗(yàn)證。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)利用病毒感染植物后植物對(duì)病毒RNA序列進(jìn)行特異性識(shí)別和降解的機(jī)制，將目標(biāo)基因序列融入病毒序列中，使感染重組病毒的植物體內(nèi)病毒RNA和目標(biāo)基因mRNA序列均被識(shí)別和降解，是一種高效抑制基因表達(dá)的技術(shù)方法。截至目前，已有多個(gè)病毒誘導(dǎo)基因沉默載體得到構(gòu)建，成功用于水稻、二穗短柄草、高粱等禾本科植物的基因沉默實(shí)驗(yàn)，然而遺憾的是仍未有結(jié)縷草病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高效快速抑制結(jié)縷草內(nèi)源基因表達(dá)的方法，通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

（1）結(jié)縷草目的基因片段的克隆。

在已知結(jié)縷草目的基因序列情況下，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增目的基因片段的上下游引物，設(shè)計(jì)原則保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大于100bp，同時(shí)在上下游引物5’端分別添加限制性?xún)?nèi)切酶MluI和PacI的識(shí)別堿基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取結(jié)縷草RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用高保真酶PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。電泳、切膠回收預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，連接平末端PCR產(chǎn)物克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布抗性平板，挑取克隆，用載體自帶引物PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆后，測(cè)序確認(rèn)PCR產(chǎn)物的正確性。

在結(jié)縷草目的基因序列未知情況下，可以根據(jù)目的基因在其它物種的同源基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物先從結(jié)縷草cDNA中PCR擴(kuò)增獲得部分基因序列，測(cè)序確認(rèn)序列正確性后遵照上述方法獲得目的基因片段。

（2）病毒誘導(dǎo)基因沉默載體的構(gòu)建。

提取上述測(cè)序驗(yàn)證的含有結(jié)縷草目的基因片段的PCR產(chǎn)物克隆載體質(zhì)粒和水稻東格魯桿狀病毒基因沉默載體pRTBV-MVIGS質(zhì)粒，使用MluI和PacI兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶于37℃酶切8小時(shí)；電泳、切膠回收目的基因和pRTBV-MVIGS載體酶切片段，使用T4 DNA連接酶將摩爾比為3：1的目的基因和pRTBV-MVIGS載體酶切回收片段進(jìn)行連接，連接條件為16℃8小時(shí)；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用載體酶切位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)的引物RTBV-F（序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA）和RTBV-R（序列：AGGCTGGAGGCATAAACGC）進(jìn)行菌落PCR，對(duì)克隆進(jìn)行鑒定。

（3）農(nóng)桿菌浸染結(jié)縷草植株。