[發(fā)明專利]一種高效快速抑制結(jié)縷草內(nèi)源基因表達(dá)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610092484.6
• 申請(qǐng)日: 2016-02-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105695505B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張兵;劉建秀;史經(jīng)昂;郭海林;宗俊勤;陳靜波;李丹丹;李建建;汪毅;郭愛(ài)桂
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種高效快速抑制結(jié)縷草內(nèi)源基因表達(dá)的方法，其特征在于，所述的結(jié)縷草內(nèi)源基因的cDNA全長(zhǎng)序列如序列表的序列2所示，編碼區(qū)為序列表中序列2自5’末端第147-1838位核苷酸；

所述的方法包括以下步驟：

(1)結(jié)縷草目的基因片段的克隆：提取結(jié)縷草RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因長(zhǎng)度為420bp的片段，上下游引物5’端分別加上限制性內(nèi)切酶MluI和PacI的識(shí)別堿基序列ACGCGT和TTAATTAA，測(cè)序確認(rèn)PCR擴(kuò)增結(jié)果正確性；所述克隆擴(kuò)增的目的基因片段是結(jié)縷草基因編碼區(qū)456-875核苷酸區(qū)段；

(2)病毒誘導(dǎo)基因沉默載體的構(gòu)建：將結(jié)縷草目的基因片段和水稻東格魯桿狀病毒基因沉默載體進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得連入結(jié)縷草目的基因片段的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體，挑取克隆、提取質(zhì)粒、酶切驗(yàn)證克隆正確性；

(3)農(nóng)桿菌浸染結(jié)縷草植株：將連入結(jié)縷草目的基因片段的病毒誘導(dǎo)基因沉默載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，將其擴(kuò)大培養(yǎng)，使用浸染緩沖液重懸后真空輔助浸染光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)、28℃條件下培養(yǎng)7天的結(jié)縷草植株；

(4)基因表達(dá)豐度的分子檢測(cè)：提取對(duì)照結(jié)縷草植株和農(nóng)桿菌浸染植株RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)豐度變化。

2.權(quán)利要求1所述的方法，其步驟(2)所述水稻東格魯桿狀病毒基因沉默載體為pRTBV-MVIGS，酶切用限制性內(nèi)切酶為MluI和PacI。

3.權(quán)利要求1所述的方法，其步驟(3)所述浸染緩沖液配方為10mM嗎啉乙磺酸，10mM氯化鎂，7.5mM氯化鈣，300mM乙酰丁香酮，pH值為5.6。

4.權(quán)利要求1所述的方法，其步驟(3)所述真空輔助浸染結(jié)縷草植株為28℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)7天的結(jié)縷草幼苗。

5.權(quán)利要求1所述的方法，其步驟(3)所述真空輔助浸染結(jié)縷草植株真空維持時(shí)間為5分鐘。

6.權(quán)利要求1所述的方法，其步驟(4)所述農(nóng)桿菌浸染植株為真空輔助浸染后于28℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)21天的結(jié)縷草植株，對(duì)照植株為28℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)28天的結(jié)縷草植株。