[發明專利]一種用于篩選具有促血管新生活性的藥物的細胞模型及其用途和使用方法

在審

• 申請號: 201610090360.4
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105586359A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 譚銳;顧健
• 申請（專利權）人: 西南交通大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/53;C12N5/10;C12N15/66;G01N33/68;C12Q1/66
• 代理公司: 成都華風專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

技術領域

本發明涉及一種用于篩選具有促血管新生活性的藥物的細胞模型，屬于醫藥生物 技術領域。

背景技術

血管可為機體提供氧氣、營養物質、生長因子、荷爾蒙及蛋白水解酶等，對于機體 組織起著至關重要的作用。血管內皮生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor， VEGF)家族是一類能與肝素結合的二聚體糖蛋白分子，并能特異性地作用于血管內皮細胞， 是血管內皮細胞特異的有絲分裂素，具有增加微靜脈、小靜脈通透性，促進血管內皮細胞分 裂、增殖以及誘導血管形成等作用。此外，腫瘤細胞的擴散及生長過程中往往涉及血管的新 生和VEGF的高表達，目前已有針對VEGF及其受體的抗腫瘤藥物。

隨著生命科學的快速發展，基于檢測報告基因的藥物篩選方法近年來取得了較大 的發展和廣泛的應用，其涉及完整細胞，在活細胞自然條件下研究藥物對生命體功能的影 響，更接近體內的生化過程，可以較為準確地了解藥物的生物學特性。

現有的體外篩選模型多是以靶基因調控序列中的特定轉錄因子或受體的結合位 點為靶點，其靶點單一，篩選得到的只是單單針對某一結合位點的有效物質，而基因啟動子 序列中往往含有多個、多種不同調控因子的結合位點。動子為篩選序列（靶點），可望獲得影 響該基因表達的一大類物質，在具備特異性篩選的同時，又涵蓋了更廣的篩選范圍，對于藥 物的分類篩選及隨后的分子藥理學研究提供更為方便的線索。

若一種物質能使VEGF的表達上調（增加），則表明此物質很可能是一種很好的具有 促血管新生活性的藥物；若一種物質能使VEGF的表達下調（減少），則表明此物質很可能是 一種具有抑制腫瘤的活性的藥物。

盧瓊報道了基于VEGF啟動子構建的藥物篩選模型，但并沒有公開所用的基因片段 的堿基序列，本領域技術人員無從知曉此篩選模型的具體結構和構建方法（盧瓊，腦缺血藥 物篩選細胞模型的構建及應用研究，西南交通大學學位論文，2014年）。

發明內容

為了構建一種用于篩選具有促血管新生活性的藥物的細胞模型，本發明提供了一 種基因構建物。

本發明提供的基因構建物從5’端到3’端依次含有：VEGF啟動子基因-1106bp～+ 113bp序列和報告基因序列。

以大鼠為例，VEGF基因-1106bp～+113bp序列詳見SEQNO.1：

進一步地，上述報告基因選自：熒光蛋白基因和/或熒光素酶基因。

優選地，上述熒光蛋白基因為綠色熒光蛋白（GFP）基因或紅色熒光蛋白（RFP）基 因；上述熒光素酶基因為螢火蟲熒光素酶基因。

紅色熒光蛋白中E2-Crimson較為常用。

本發明進一步提供了一種重組載體，此載體含有上述的基因構建物。

本發明中的載體指在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉移至受體 細胞的一種能自我復制的DNA分子，常用的有質粒、噬菌體和動植物病毒。

本發明進一步構建了一種穩定的細胞，此細胞含有上述的重組載體或其基因組中 整合上述的基因構建物。

進一步地，此細胞選自HEK293細胞、Hela細胞、CHO細胞或干細胞中的任一種。

本發明進一步提供了構建上述重組載體的方法，它包括如下步驟：

（1）合成VEGF啟動子基因-1106bp～+113bp序列；

（2）將步驟（1）合成的序列與帶有報告基因的報告載體分別進行酶切，連接報告載體與 啟動子片段，轉化大腸桿菌，抗性篩選，挑選陽性轉化子，提取質粒，即得重組載體。

進一步地，步驟（2）中，所述報告載體為帶有報告基因的pSC基礎質粒。

此處所述的報告基因同上述，即選自熒光蛋白基因和/或熒光素酶基因。

本發明進一步提供了構建上述的穩定的細胞的方法，即將上述的重組載體轉染 HEK293細胞、Hela細胞、CHO細胞或干細胞中的任一種。

本發明進一步提供了上述的穩定的細胞的用途，其用于篩選可提高VEGF表達水平 的藥物。

本發明還提供了一種篩選可調節VEGF表達水平或具有促血管新生活性的藥物的 方法，其包括如下步驟：

（1）將候選藥物給予上述的穩定的細胞；

（2）檢測所述細胞中報告基因的表達情況；