[發明專利]基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法

在審

• 申請號: 201610089583.9
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105525025A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 楊永華;陸桂華;戚金亮;楊榮武;龐延軍;朱銀玲;孔令如;湯程貽
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術領域

本發明屬于土壤微生物學技術領域，具體涉及大田種植方式下，基于16SrDNA深度測序 檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法。

背景技術

根際(Rhizosphere)被定義為緊密圍繞著有生命力根系的生物活性區域，其中包含大量 微生物，例如細菌、放線菌和真菌等，也包括一些藻類和病毒等，范圍一般為距離根表面1cm 以內。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物會對根際微生物的生長發育產生 影響；而根際微生物又參與土壤有機質的分解、腐殖質的形成、養分的轉化和循環等多種生 理生化過程，尤其是其中的固氮菌群，通過生物固氮作用在常溫下把氮氣轉化為能被植物利 用于合成各種氨基酸的氨。土壤根際微生物群落不僅受到植物根系影響，也受土壤類型、農 業耕作管理、季節變化、重金屬污染、殺蟲劑處理等影響，同時也受到檢測技術的影響。因 此，準確檢測不同基因型植物包括轉基因作物的根際微生物群落組成、結構、多樣性及相對 豐度差異，是判斷和評價不同基因型植物對土壤微環境影響的重要基礎，也是評估轉基因作 物釋放對土壤微生態風險的重要基礎。

傳統的用于研究微生物的分離培養法主要有平板培養法和顯微鏡觀察等方法，雖然簡單 方便，至今仍然是一種不可替代的研究手段，但也存在一些弊端，即上述方法無法研究土壤 中大量的且不可培養的微生物。BIOLOG微平板分析法適用于檢測可培養的且生長速度較快 的微生物及其代謝多樣性，但是實驗結果并不能完全代表原位條件下微生物代謝多樣性的結 果，樣品的處理方法、培養條件以及BIOLOG微平板的類型等都會對結果造成一定程度的誤 差。醌指紋法的優點是簡單快速，因此也被廣泛地應用于微生物細胞結構多樣性的分析中， 但是醌指紋法也存在一些不足，例如它不能具體反映到哪個屬、種的多樣性變化等。磷脂脂 肪酸(PLFA)分析法是基于PLFA是活體細胞膜的一個重要組成部分，含量大約占細胞干重 的5％；用PLFA的變化來反映土壤生態系統中微生物的種類組成和數量變化，該方法不需 要進行微生物培養，可直接鑒定微生物群落多樣性變化，但該方法與PLFA是否完全提取以 及操作過程中PLFA是否穩定有著很大的關系。

土壤微生物的遺傳多樣性是指土壤生態系統中的微生物在基因水平上所攜帶的遺傳物 質和遺傳信息的總和；與高等生物相比，微生物的遺傳多樣性更加突出，不同微生物種群間 的遺傳物質和遺傳信息具有非常顯著的差異。土壤微生物遺傳多樣性的分析方法主要包括兩 類：第一類是基于雜交的分析方法，第二類是基于PCR的分析方法。雜交分析方法是基于核 酸分子的堿基互補配對原理，利用特異性的探針與待測樣品的核酸分子進行雜交的過程；雜 交技術是通過測定DNA重組率或DNA雜交動力相似度來研究土壤微生物的遺傳多樣性，用 于研究微生物遺傳多樣性的雜交探針主要包括rRNA基因探針、抗性基因探針和編碼代謝酶 基因探針等，其中應用比較普遍的雜交技術包括熒光原位雜交(FluorescenceinSitu Hybridization,FISH)技術，肽核酸(peptidenucleicacids,PNA)雜交技術以及限制性片段長度 多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技術等，各有優點，但均是低通量的分 析方法。