[發明專利]基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法

在審

• 申請號: 201610089583.9
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105525025A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 楊永華;陸桂華;戚金亮;楊榮武;龐延軍;朱銀玲;孔令如;湯程貽
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

1.一種基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法，其特征是由以下 步驟構成：

(1)大田試驗地設計，每一種基因型大豆種植于三個或三個以上小區，每個小區面積不小 于12m²，每個小區有兩個取樣點，每個取樣點取兩棵或兩棵以上植株；

(2)先除去地面雜草和枯枝落葉，鏟除大田土壤表面1-2cm的表土，然后將在盛花期或 苗期或鼓粒期或成熟期的大豆植株連根從土中取出，用抖落法取根系抖落土作為系統 對照，混合均勻并去除根毛，于零下20℃-零下70℃保存，再用捋取法取下緊粘于大 豆根的根際土壤，混合均勻并去除根毛，并于零下70℃保存；

(3)從上述各土壤樣品中，用可去除土壤中殘留的腐殖質及幾乎所有其他的PCR抑制因子 的PowerSoilDNAIsolationKit提取高質量微生物宏基因組DNA；

(4)用雙標簽融合引物對，其一含P5Illumina接頭序列、8核苷酸的標簽以及特異性引 物515F，515F的核苷酸序列是5‘-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，另一引物含P7 Illumina接頭序列、8核苷酸的標簽以及特異性引物806R，806R的核苷酸序列是5 ‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，做PCR擴增所述宏基因組DNA中16SrDNA的V4高變 區片段以構建文庫；

(5)對合格的文庫用IlluminaMiseq平臺進行雙末端250個核苷酸邊合成邊測序的深度測 序，并對邊合成邊測序的讀取序列READS進行質量控制；

(6)把純凈的成對READS拼接成TAG，然后聚類成“可操作分類學單元”，英語縮寫為OTU， 再做物種組成、結構、多樣性及相對豐度差異的顯著性分析；

(7)以根系抖落土壤微生物群落的組成、結構及多樣性作為系統對照，克服土壤異質性的 影響，準確測定根際土壤原核微生物群落組成、結構、多樣性、相對豐度，比較不同 大豆之間的異同。

2.根據權利要求1所述一種基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的 方法，其特征在于所述的系統對照為大田種植方式下的大豆根系抖落土壤，每種基因型大豆 的系統對照土壤樣品至少3個生物學重復；每種基因型大豆的根際土壤樣品至少3個生物學 重復。

3.根據權利要求1所述一種基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的 方法，其特征在于所述的高質量宏基因組DNA用PowerSoilDNAIsolationKit提取，其 中，土壤樣品的均質化在康寧LSE渦旋混合器上以最大轉速2850rpm運轉10分鐘完成。

4.根據權利要求1所述一種基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的 方法，其特征在于所述的深度測序是在IlluminaMiseq平臺上，以PE250模式做16SrDNA 的V4高變區片段高通量測序，每個系統對照土壤樣品DNA至少產出3.8萬條有效TAG以用于 聚類成OTU；每個根際土壤樣品DNA至少產出13萬條有效TAG以用于聚類成OTU。