[發明專利]猴SIV病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610089042.6
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105647913A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 李丹丹;高慎陽;徐義剛;邱索平
• 申請（專利權）人: 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/52
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技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的檢測方法及抗原技術領域，具體涉及一種猴SIV 病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

背景技術

猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiencyVirus,SIV)是一種外源性逆轉錄病 毒，對人具有潛在的感染性。SIV感染繁殖猴群將直接影響其在生物醫學研究中的應用。因 此，實驗猴輸入國、出口國的檢疫要求都明確規定實驗猴SIV抗體必須為陰性。目前，除了美 國BioReliance和VRL等少數幾個實驗室擁有實驗猴SIV的ELISA試劑盒之外，市場上還沒有 同類產品出售。國外試劑盒雖然準確率高，但價格昂貴，若進行大規模的SIV血清學調查，國 內實驗猴養殖單位難以承受，因此往往只對即將出口的實驗猴購買少量國外試劑盒做一次 性檢測。如果能夠建立一種快速、準確的實驗猴SIV抗體檢測方法，并研制出操作簡單、準確 率高、價格低廉的試劑盒，將有助于國內開展實驗猴SIV的檢測工作。

免疫梳方法是能夠對病毒血清抗體進行定性、定量檢測的一項新型體外診斷技 術，這種技術突破性地將病毒抗原點布在具有極強蛋白吸附力的硝酸纖維膜上，把包被好 的抗原膜貼附于PVC板以增加膜的強度和硬度，經機器裁切制成免疫梳。將此免疫梳插入稀 釋好的待檢血清樣本時，特異性抗體與抗原結合并固著于膜上，再通過酶標二抗底物反應， 染色后，抗體陽性的樣本表現為肉眼可見的紅色斑點，陰性則無顏色變化。膜經過圖像處理 系統數據化后可以進行定量分析。

發明內容

本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種猴SIV病 毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用。

本發明是通過以下的技術方案實現的：

1、一種用于構建猴SIV病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，引物SIVF：如序列表Seq No.1所示，引物SIVR：如序列表SeqNo.2所示。

2、一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-SIV，序列如序 列表SeqNo.3所示。

3、一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-SIV的構建方 法，包括如下步驟：

（1）根據猴SIV病毒的基因序列，設計SOE-PCR擴增引物，引物SIVF：如序列表SeqNo.1 所示，引物SIVR：如序列表SeqNo.2所示；

（2）進行SOE-PCR擴增猴SIV病毒基因；

（3）猴SIV病毒基因的回收；

（4）克隆質粒pMD18T-SIV的構建及測序；

（5）表達載體pGEX-4T-SIV的構建，序列如序列表SeqNo.3所示。

4、如上所述的一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T- SIV的構建方法，所述的步驟（2）采用SOE-PCR反應的具體步驟如下：

將混合液在95℃預變性5min，94℃變性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30 個循環，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：

SIVF引物 2 μL SIVR引物 2μL 2×Taq MasterMix 15 μL 超純水 補足至30 μL。