[發明專利]猴SIV病毒抗體的免疫梳檢測試紙及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610089042.6
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105647913A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 李丹丹;高慎陽;徐義剛;邱索平
• 申請（專利權）人: 海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70;C12N15/66;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/52
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1.一種用于構建猴SIV病毒抗體的免疫梳的SOE-PCR引物組，其特征在于，引物SIVF：如 序列表SeqNo.1所示，引物SIVR：如序列表SeqNo.2所示。

2.一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-SIV，其特征在于， 序列如序列表SeqNo.3所示。

3.一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX-4T-SIV的構建方法，其 特征在于，包括如下步驟：

（1）根據猴SIV病毒的基因序列，設計SOE-PCR擴增引物，引物SIVF：如序列表SeqNo.1 所示，引物SIVR：如序列表SeqNo.2所示；

（2）進行SOE-PCR擴增猴SIV病毒基因；

（3）猴SIV病毒基因的回收；

（4）克隆質粒pMD18T-SIV的構建及測序；

（5）表達載體pGEX-4T-SIV的構建。

4.根據權利要求3所述的一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX- 4T-SIV的構建方法，其特征在于，所述的步驟（2）采用SOE-PCR反應的具體步驟如下：

將混合液在95℃預變性5min，94℃變性1min，63℃退火30s，72℃延伸1min，30 個循環，72℃總延伸10min；

上述混合液如下所示：

。

5.根據權利要求3所述的一種用于制備猴SIV病毒抗體的免疫梳的重組表達載體pGEX- 4T-SIV的構建方法，其特征在于，所述的步驟（5）pGEX-4T-SIV的構建方法具體步驟如下：利 用EcoRⅠ與XhoⅠ分別將pMD18T-SIV和pGEX-4T-1進行雙酶切，并膠回收酶切的目的片段，將 回收的目的片段進行連接，將連接產物轉化到BL21（DE3）pLysS感受態細胞中，利用氨芐青 霉素抗性篩選陽性菌落，并提取質粒進行SmaⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，將鑒定陽性的質粒命名 為pGEX-4T-SIV。

6.一種猴SIV病毒抗體的免疫梳檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以重組表達載體pGEX-4T-SIV表達猴SIV病毒蛋白；

（2）猴SIV蛋白的純化與定量；

（3）免疫梳檢測試紙的制備：

（3.1）將步驟（1）中表達的猴SIV病毒蛋白以0.02mg/mL的濃度進行線性包被NC膜，將 膜晾干；

（3.2）用0.05g/mL的BSA封閉液封閉NC膜過夜，棄去封閉液后再次晾干；

（3.3）將包被好的NC膜裁剪成標準尺寸的試紙條，依次按一定間距整齊固定于PVC板 上，十二條為一組或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳檢測試紙，最終于自封袋中低溫保 存備用。

7.根據權利要求6所述的一種猴SIV病毒抗體的免疫梳檢測試紙的制備方法制備的一 種猴SIV病毒抗體的免疫梳檢測試紙。