[發(fā)明專利]小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610088967.9
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105624143B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 元英進(jìn);謝澤雄;吳毅;李炳志;王霞
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/90;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發(fā)明涉及合成生物學(xué)染色體合成領(lǐng)域，特別涉及小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法。本發(fā)明將多個長約3kb的小片段DNA共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母細(xì)胞中，利用釀酒酵母自身高效的同源重組特性，實現(xiàn)對不大于30kb釀酒酵母V號染色體的替換工作，替換的正確性通過PCR的方法進(jìn)行驗證。能夠快速替換大片段真核生物染色體、并使之能夠發(fā)揮正常功能的大片段DNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及合成生物學(xué)染色體合成領(lǐng)域，特別涉及小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法。

背景技術(shù)

生物基因組攜帶了決定生物基本性狀的遺傳信息，人工DNA合成技術(shù)和DNA大片段操作技術(shù)推動了基因組人工合成研究的進(jìn)步。合成生物學(xué)的發(fā)展推動了通過人工設(shè)計合成來“寫”基因組信息標(biāo)志著“人造生命”的開始。

近年來，丙型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、X174噬菌體、T7噬菌體、水稻(Oryzasativa)葉綠體和小鼠(Mus musculus)線粒體等基因組序列先后實現(xiàn)了人工改造與合成,尤其是活性人工基因組設(shè)計與合成的成功使人工基因組合成工作受到了世界的極大關(guān)注,即支原體基因組和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體的合成。Venter研究組開發(fā)了體外組裝和酵母體內(nèi)組裝相結(jié)合的方式進(jìn)行基因組合成，于2008年實現(xiàn)了生殖支原體(Mycoplama genitalium)基因組的全化學(xué)人工合成,然后利用基因組轉(zhuǎn)移的技術(shù)于2010年將人工合成的蕈狀支原體(Mycoplasma mycoides)基因組轉(zhuǎn)入移除自身染色體的山羊(Capra aegagrus hircus)支原體(Mycoplasma capriolum)細(xì)胞中,得到了能夠發(fā)揮正常功能的全新的支原體細(xì)胞。2011年,Boeke研究組分別對釀酒酵母Ⅵ號染色體左臂和Ⅸ號染色體右臂進(jìn)行了人工設(shè)計,并于2014年成功合成了具有生物學(xué)活性的完整Ⅲ號人工染色體,標(biāo)志著基因組人工合成工作進(jìn)入真核生物領(lǐng)域。

生物染色體的長度較長，尤其是真核生物。通過體外或體外組裝和染色體轉(zhuǎn)移的技術(shù)來合成全新的、能夠發(fā)揮正常功能的真核生物染色體困難極大，操作可行性較小。因此，一種能夠快速替換大片段真核生物染色體、并使之能夠發(fā)揮正常功能的大片段DNA替換技術(shù)顯得極具開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法。本發(fā)明的目的是為了解決不大于30kb大片段釀酒酵母V號染色體的替換問題，提出利用多個小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了小片段DNA共轉(zhuǎn)化替換大片段DNA的方法，多個小片段DNA共轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞中，利用釀酒酵母的同源重組特性，實現(xiàn)大片段DNA的替換。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述小片段DNA為不大于4kb的DNA；所述大片段DNA為不大于30kb的DNA。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中相鄰兩個所述小片段DNA之間存在不大于750bp的重疊區(qū)域。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中采用兩個篩選標(biāo)記尿嘧啶(URA3)和卡那霉素抗性(KanMX)的組合物或尿嘧啶(URA3)和亮氨酸(LEU2)的組合對所述大片段DNA的替換進(jìn)行表型表征。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述大片段DNA為酵母染色體。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述大片段DNA為酵母V號染色體。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述方法中所述小片段DNA選自如SEQ ID No.1～SEQ ID No.17所示的的核苷酸序列。

本發(fā)明提供了所述方法制得釀酒酵母菌株。