[發明專利]一種喹諾酮納米分子印跡聚合物制備方法與應用

在審

• 申請號: 201610088952.2
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105713156A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 唐斯萍;楊穎群;許志鋒;馮泳蘭
• 申請（專利權）人: 衡陽師范學院
• 主分類號: C08F292/00
• 分類號: C08F292/00;C08F220/06;C08F222/14;G01N21/31;G01N33/535;G01N33/543;C08J9/26
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

1.一種喹諾酮納米分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）固相載體玻璃珠上引入抗生素

將250~300g玻璃珠加入到120~160mL、1~4mol/L的NaOH水溶液中，加熱沸騰10~15分鐘，取出玻璃珠用水洗至洗液的pH=8~9，烘干得到羥基化玻璃珠；

將羥基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3mL3-胺丙基三甲氧基硅烷，劇烈搖動后，室溫下放置12~16小時，過濾、丙酮沖洗，得到硅烷化玻璃珠；

在20mL乙腈和80mLpH6.0PBS緩沖溶液中，加入80~120mg喹諾酮類抗生素、80~100mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽和120~150mgN-羥基琥珀酰亞胺，室溫放置10~15分鐘后倒入100g上述硅烷化玻璃珠中，加1mol/L的NaOH水溶液調節反應液pH至7.4，室溫下反應2~3h，抽濾，水洗，干燥，收集喹諾酮抗生素衍生玻璃珠；

（2）合成喹諾酮類抗生素印跡的納米印跡聚合物

將8.0~10.0mmol甲基丙烯酸、4.0~5.0mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯、3.0~3.5mmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、1.0mmol二乙基二硫代氨基羧酸芐酯和0.1~0.15mmol四（3-巰基丙酸）季戊四醇酯溶于10g的乙腈中，得到混合溶液，并所述混合溶液中通氮氣20分鐘；

取25~30g所述喹諾酮類抗生素衍生玻璃珠于平底杯中，往燒杯中通氮氣20分鐘；

將所述混合溶液倒入上述燒杯中，紫外照射1~3分鐘，得到反應混合物；

將所述反應混合物倒入至固相萃取管中，用6~8床的冷乙腈洗滌玻璃珠，得到半成品玻璃珠，通氮氣10分鐘；

取220~270mgPEG4000溶于8mL乙腈中，通氮氣5分鐘后，倒入上述半成品玻璃珠表面，搖動混勻，紫外照射1~3分鐘，將所述反應混合物倒入至固相萃取管中，用6~8床的冷乙腈洗滌玻璃珠，然后用100mL、60~70℃乙腈淋洗，得到喹諾酮類抗生素印跡的納米分子印跡聚合物溶液，自然冷卻至室溫，用微孔超離心過濾器離心分離得到喹諾酮類抗生素納米分子印跡聚合物溶液。

2.如權利要求1所述的喹諾酮納米分子印跡聚合物在檢測喹諾酮抗生素方面的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述喹諾酮抗生素的檢測包括以下步驟：

（1）酶標物辣根過氧化物酶-模板分子HRP-T的合成

將20~30mg喹諾酮抗生素溶于0.3mL乙腈和2.0mL、pH6.0的MES緩沖液中，再加入0.2~0.4mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽和0.3~0.6mgN-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應15分鐘后，立即與10mL含5~8mg辣根過氧化物酶的pH7.40的PBS緩沖溶液孵化2小時，然后用4.0~5.0mLPBS緩沖液洗去未聯接的抗生素，用微孔超離心過濾器在轉速3500rpm下分離得到酶標物HRP-T溶液；

（2）標準曲線圖制作

通過酶聯免疫競爭吸附法測定不同濃度喹諾酮抗生素的吸光度，建立抗生素濃度-吸光度的標準曲線圖；

（3）喹諾酮抗生素的檢測

將預處理后的待檢測物通過酶聯免疫競爭吸附法測定喹諾酮抗生素的吸光度，根據該吸光度與標準曲線圖比對，獲取待檢測物中喹諾酮抗生素的濃度；

在步驟（2）和（3）中，所述酶聯免疫競爭吸附法具體為：將40μL、濃度為0.04~0.06mg/mL喹諾酮納米分子印跡聚合物溶液包被在微孔盤中；PBS溶液洗滌，然后加入300μL含質量濃度為1.5%的Tween20和質量濃度為0.15%的BSA的PBS溶液；孵化1~1.5h，PBS溶液洗滌，然后每個孔中加入100μL的酶標物HRP-T溶液和喹諾酮抗生素待測液室溫下孵化1h，用含Tween20和BSA的PBS溶液洗滌，加入60~100μLTMB試劑顯色反應10分鐘，加入60~100μL0.5mol/LH₂SO₄溶液終止反應；酶標儀讀取器讀取450nm處每個微孔溶液的吸光度。