[發(fā)明專利]釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610088284.3
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN105624187A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 元英進(jìn);謝澤雄;李炳志
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的方法。

背景技術(shù)

作為真核生物的模式菌株，釀酒酵母在醫(yī)藥、食品等眾多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，釀酒酵 母基因或者染色體DNA序列的定點(diǎn)突變對于真核生物基因功能的研究提供了重大參考意 義。釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的引入一般是通過兩步法完成的：1.利用釀酒酵母的同源重 組在待引入突變的位置插入篩選標(biāo)記；2.利用攜帶突變的DNA敲除引入的篩選標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)基 因組單位點(diǎn)突變。不過，該方法需要利用PCR構(gòu)建攜帶篩選標(biāo)記的表達(dá)盒，實(shí)驗周期，操作繁 瑣，而且一般每次只能對一個目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。如果利用該方法同時向多個位點(diǎn)引 入定點(diǎn)突變的話，則需要構(gòu)建多個的攜帶篩選標(biāo)記的表達(dá)盒，操作更加繁瑣，效率低下。

CRISPR/CasCRISPR/CasCRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一 種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)通過將入侵噬菌體 和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)的CRISPRRNAs(crRNAs)來指導(dǎo)同源序列的 降解，從而提供免疫性。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通過堿基配對與 tracrRNA(trans-activatingRNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈RNA。而通過人工設(shè)計這兩種RNA，可以改造 形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA(shortguideRNA)，足以引導(dǎo)Cas9對DNA的定點(diǎn)切割。

基因敲除動物模型一直以來是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作 用靶標(biāo)的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、 嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術(shù)的要求很高，而且費(fèi)用大，耗時較長， 成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術(shù)比較成熟的實(shí)驗室，利用傳統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建基因 敲除大、小鼠一般也需要一年以上。CRISPR/Cas技術(shù)是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES細(xì)胞打靶和 TALEN等技術(shù)后可用于定點(diǎn)構(gòu)建基因敲除大、小鼠動物的第四種方法，且有效率高、速度快、 生殖系轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)及簡單經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在動物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景將非常廣闊。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的方法。本發(fā)明將CRISPR/Cas9 技術(shù)和釀酒酵母共轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合，提出全新的對釀酒酵母基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變的技術(shù)， 耗時短，操作簡單。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種釀酒酵母基因組定點(diǎn)突變的方法，包括如下步驟：

步驟1：選擇突變位點(diǎn)的靶位點(diǎn)；

步驟2：酵母轉(zhuǎn)化，引入釀酒酵母基因組點(diǎn)突變；

步驟3：對點(diǎn)突變進(jìn)行驗證。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中步驟1選擇突變位點(diǎn)位于PAM序列 (NGG)中或者PAM序列前11bp內(nèi)的作為靶位點(diǎn)。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中步驟2中所述酵母轉(zhuǎn)化為向釀酒酵 母細(xì)胞中轉(zhuǎn)化Cas9質(zhì)粒、guideRNA質(zhì)粒和攜帶突變后的DNA片段。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述guideRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在待 修復(fù)位點(diǎn)附近發(fā)揮作用，將釀酒酵母基因組進(jìn)行切割處雙鏈切口，實(shí)現(xiàn)供體DNA的高效重 組。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述點(diǎn)突變選自釀酒酵母V號染色 體上位點(diǎn)9、位點(diǎn)14或位點(diǎn)16。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中步驟3所述驗證通過PCR和Sanger DNA測序驗證。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述點(diǎn)突變至少為1個。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述點(diǎn)突變?yōu)獒劸平湍竀號染色體 上位點(diǎn)14的A突變?yōu)镃。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述點(diǎn)突變?yōu)獒劸平湍竀號染色體 上位點(diǎn)16的A突變?yōu)镃。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述方法中所述點(diǎn)突變?yōu)獒劸平湍竀號染色體 上位點(diǎn)16的C突變?yōu)镚。

本發(fā)明還提供了所述的方法構(gòu)建的釀酒酵母突變菌株。