[發明專利]一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法

在審

• 申請號: 201610087817.6
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105504036A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 劉波;蔡成固
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/81;C12N15/29;C12N15/10;C12R1/84
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

技術領域

本發明涉及蛋白突變技術領域，特別是涉及一種具有強熱穩定性的甜味蛋白 monellin突變體及其制備方法。

背景技術

甜味蛋白monellin是西非植物Dioscoreophyllumcumminsii中提取的一種天然 甜味劑，具有強烈的甜味，甜度在相同條件下約為相同質量蔗糖的3000倍，天然的monellin 蛋白是由兩條不同的肽鏈通過共價鍵結合在一起，由A鏈和B鏈組合而成，研究發現天然的 monellin蛋白在高溫下易失去活性，1989年Kim等人通過基因工程方法將兩條肽鏈結合成 一條蛋白鏈，使其熱穩定性得到大大提升，在寬范圍PH下保持穩定，同時其甜度未發生太大 變化。由于本身不含糖分，可以作為糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有 效的預防兒童齲齒的發生，具有非常大的市場潛力。單鏈monellin蛋白在65℃下處理就會 失去活性，使其在生產和運輸過程中受到了限制。

單鏈monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表達成功，如大腸桿菌表達 系統、植物表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統、但是由于這些表達系統產量和有毒代謝物質 的問題使得monellin蛋白無法大規模發酵生產。采用甲醇誘導畢赤酵母發酵使得monellin 蛋白產量得到很大提升，但是由于有毒物質甲醇的加入，發酵產品安全問題成為隱患。

發明內容

本發明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種具有強熱穩定性的甜味蛋白 monellin突變體及其制備方法。針對現有的技術不足，對單鏈monellin進行了定點突變研 究，得到一種熱穩定性和甜度均提升的突變體E23A，并在畢赤酵母中成功表達，解決了甜味 蛋白在生產運輸中易降解的技術難題，降低了monellin蛋白在生產運輸中的成本，同時保 持其甜味效果，為甜味蛋白大規模工業化市場化打下基礎。采用PGAPZαA質粒可以將目的蛋 白直接分泌到胞外，節省了后期純化成本，由于本身為GADPH自誘導型啟動子，發酵過程中 不需要添加任何誘導劑，減少了發酵過程中的染菌概率，同時沒有任何有毒代謝物質，保證 了該蛋白作為食品添加劑的安全。

本發明的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法技術方 案為，一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，將野生型單鏈monellin基因第23 位氨基酸谷氨酸(Glu)定點突變為丙氨酸(Ala)。

與野生型單鏈monellin蛋白相比，甜味未下降，熱穩定性提高20℃。

所述的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體的制備方法，包括以下步 驟：

(1)構建野生型單鏈monellin蛋白表達載體；

(2)將步驟(1)中進行定點突變得到突變基因，挑取陽性轉化子測序驗證；

(3)將步驟(2)中測序正確的質粒轉化入畢赤酵母中，篩選出成功轉化的畢赤酵 母；

(4)在YPD培養基中誘導表達蛋白，時間為3天；

(5)將步驟(4)中表達的蛋白純化。

步驟(1)為，構建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達質粒PGAPZαA。

步驟(2)突變位點特異性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTGAA- 3’]；下游P2：[5’-CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3’],上游P3：[5’-CTGTTGACGAGGCTAACAAAATAGGTCAGTATG-3’]；下游P4：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。

步驟(2)中，設計好引物后，用Xhol和NotI兩種限制性內切酶處理PGAPZαA-SCM，膠 回收目的基因和開環質粒，根據以下體系進行PCR反應：

上述PCR反應按照如下程序進行：