[發明專利]一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體及其制備方法

在審

• 申請號: 201610087817.6
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105504036A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 劉波;蔡成固
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/81;C12N15/29;C12N15/10;C12R1/84
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

1.一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，其特征在于，將野生型單鏈 monellin基因第23位氨基酸谷氨酸(Glu)定點突變為丙氨酸(Ala)。

2.根據權利要求1所述的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體，其特征在 于，與野生型單鏈monellin蛋白相比，甜味未下降，熱穩定性提高20℃。

3.如權利要求1所述的一種具有強熱穩定性的甜味蛋白monellin突變體的制備方法， 其特征在于，包括以下步驟：

(1)構建野生型單鏈monellin蛋白表達載體；

(2)將步驟(1)中進行定點突變得到突變基因，挑取陽性轉化子測序驗證；

(3)將步驟(2)中測序正確的質粒轉化入畢赤酵母中，篩選出成功轉化的畢赤酵母；

(4)在YPD培養基中誘導表達蛋白，時間為3天；

(5)將步驟(4)中表達的蛋白純化。

4.根據權利要求3所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(1) 為，構建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達質粒PGAPZαA。

5.根據權利要求4所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(2) 突變位點特異性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTGAA-3’]；下游P2： [5’-CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3’],上游P3：[5’-CTGTTGACGAGGCTAACAAAATAG GTCAGTATG-3’]；下游P4：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。

6.根據權利要求5所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，設計好引物后采用重疊PCR方法，根據以下體系進行PCR反應：

再以該PCR產物為模板用上游引物P1和下游引物P4按照上述PCR反應體系照如下程序 進行：

95℃預變性5min；95℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃終延伸 10min。

7.根據權利要求6所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，用Xhol和NotI內切酶消化PCR產物經T4DNA連接酶連接到經兩種酶處理后的PGAPZαA開 環空質粒上，轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固體培養 基上，過夜培養挑取陽性單菌落并提取質粒，測序驗證突變結果，構建突變質粒PGAPZαA- E23A將正確的突變質粒保存備用。

8.根據權利要求7所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(3) 中所述的畢赤酵母為畢赤酵母GS115。