[發明專利]羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物及其應用

有效

• 申請號: 201610087583.5
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN107089947B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 楊凌;葛廣波;金強;馮磊;崔京南;王丹丹
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D219/06
• 分類號: C07D219/06;C07D405/12;C07D409/12;C09K11/06;C12Q1/44
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

一種羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物及其應用。該特異性探針底物為1,3?二氯?7?羥基?9,9?二甲基?2(9H)?吖啶酮(簡稱DDAO)的芳香酯(簡稱DDAE)。該底物可用于羧酸酯酶2(CE2)活性快速定量檢測，以及羧酸酯酶2抑制劑與激活劑的快速篩選與評估。羧酸酯酶2活性快速定量檢測流程如下：選擇DDAE水解反應為探針反應，在含有羧酸酯酶2的緩沖液體系中加入適宜探針底物，在線性反應區間內通過定量檢測單位時間內其水解代謝產物DDAO的生成量來測定各種體外生物樣品中羧酸酯酶2酶的真實活性。該探針具有良好的選擇性且水解產物DDAO的熒光發射波長(662nm)處于近紅外區域，可顯著減少生物樣本自身背景熒光，提高靈敏度，具有良好的實用性和應用前景。

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物及其應用。

背景技術

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CE)是一種重要I相藥物代謝酶，廣泛分布于多種哺乳動物細胞中。該酶參與多種酯類藥物、環境毒物及致癌物的解毒和代謝，能有效催化含羧酸酯鍵、酰胺鍵、硫酯鍵等外源性物質的水解。在人體中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(CE1)和羧酸酯酶2(CE2)兩個亞型，二者在組織分布和底物特異性上存在顯著差異。CE2在人腸道和腫瘤組織中高表達，在提高很多前藥的口服生物利用度中起著十分重要作用，并且其活性也會影響很多酯類抗癌試劑(如伊立替康和卡培他汀)的療效。機體羧酸酯酶的組織分布與功能差異不僅決定其處置酯類外源物的能力，還與肥胖、動脈粥樣硬化、高脂血癥、高膽固醇血癥、脂肪肝等代謝綜合癥發生發展密切相關。并且，羧酸酯酶2含量在結腸癌不同發病階段具有顯著差異，可作為結腸癌診斷的早期標志物。因此，精確測量不同生物體系中CE2的真實活性在臨床上意義十分重大。

截至目前，CE2的定量方法有酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、免疫印跡法(WesternBlotting)、質譜法和熒光法等。熒光檢測方法由于高靈敏度、低侵襲性、快速和高通量等優點而備受歡迎，但是已有的熒光底物的發射波長都較短(λ_em＜630nm)，受生物基質自發熒光干擾較大，定量誤差較大。而近紅外熒光底物(λ_em＞650nm)可克服上述缺點，提高靈敏度。故而開發高選擇性的人羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物具有非常廣泛的應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種羧酸酯酶2的熒光探針底物及其制備方法與應用，該探針底物的水解產物具有良好的熒光屬性。利用該探針反應可對多種生物體系中CE2的分布和功能進行定量評價。

一種羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物，該底物為1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(簡稱DDAO)的芳香酯(簡稱DDAE)，其結構通式為：

其中，R為苯基、對甲基苯基、對乙基苯基、對丙基苯基、對硝基苯基、對氯苯基、2-呋喃基、2-噻吩基或4-乙氧基苯基取代基中的任意一種。

一種羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物在生物檢測中的應用，所述熒光探針底物可被羧酸酯酶2特異性催化并生成水解產物DDAO，該產物具有良好的熒光發射屬性，可采用熒光檢測器實現產物的快速超靈敏檢測；DDAO熒光檢測條件為：激發波長600nm，在630～700nm進行熒光發射譜的檢測；該熒光探針底物可用作羧酸酯酶2活性快速定量檢測，以及羧酸酯酶2抑制劑的快速篩選與評估。

羧酸酯酶2活性快速定量檢測方法為：以DDAE水解反應作為CE2的特異性探針反應，CE2特異性催化DDAE并生成水解產物DDAO，該產物具有良好的熒光屬性，可通過定量檢測單位時間內熒光強度的變化測定CE2的真實活性。

羧酸酯酶2抑制劑的快速篩選與評估方法為：以DDAE水解反應作為CE2的特異性探針反應，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態下單位時間內水解產物DDAO的生成量評估該生物體系中CE2的殘余活性，進而實現CE2抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。