[發明專利]羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物及其應用

有效

• 申請號: 201610087583.5
• 申請日: 2016-02-17
• 公開（公告）號: CN107089947B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 楊凌;葛廣波;金強;馮磊;崔京南;王丹丹
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D219/06
• 分類號: C07D219/06;C07D405/12;C07D409/12;C09K11/06;C12Q1/44
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一種羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物，其特征在于：該底物為1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯，其結構通式為：

其中，R為苯基、對甲基苯基、對乙基苯基、對丙基苯基、對硝基苯基、對氯苯基、2-呋喃基、2-噻吩基或4-乙氧基苯基取代基中的任意一種。

2.一種如權利要求1所述的羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物的應用，其特征在于：所述熒光探針底物在生理pH下可被羧酸酯酶2特異性催化并生成水解產物DDAO，該產物具有非常好的熒光發射屬性，可采用熒光檢測器實現產物的快速超靈敏檢測；DDAO熒光檢測條件為：激發波長600nm，在630～700nm進行熒光發射譜的檢測；

該熒光探針底物可用作羧酸酯酶2活性快速定量檢測，以及羧酸酯酶2抑制劑的快速篩選與評估。

3.按照權利要求2所述的羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物的應用，其特征在于羧酸酯酶2活性快速定量檢測方法為：以DDAE水解反應作為羧酸酯酶2的特異性探針反應，CE2特異性催化DDAE并生成熒光產物DDAO，可通過定量檢測單位時間內產物熒光強度的變化測定CE2的真實活性；其中所述DDAE為1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯。

4.按照權利要求2所述的羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物的應用，其特征在于羧酸酯酶2抑制劑的快速篩選與評估方法為：以DDAE水解反應作為CE2的特異性探針反應，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態下單位時間內水解產物DDAO的生成量評估該生物體系中CE2的殘余活性，進而實現CE2抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價；其中所述DDAE為1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯。

5.按照權利要求3所述的羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物的應用，其特征在于所述的羧酸酯酶2活性的快速定量檢測方法，其特征在于羧酸酯酶2活性快速定量檢測的具體步驟如下：

(1)使用常用磷酸鹽緩沖液，反應溫度為20～60℃之間；孵育體系pH介于7～10.5之間；

(2)以1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯類衍生物作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；

(3)反應時間為5～30分鐘，在確保水解產物達到定量限且底物轉化率在0.1～20％之間終止反應；

(4)定量測定單位時間內水解產物生成量代入標準曲線后換算獲得CE2的活性及酶量。

6.按照權利要求4所述的羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物的應用，其特征在于所述羧酸酯酶2抑制劑篩選與評估的應用，其特征在于羧酸酯酶2抑制劑的篩選與評估方法具體步驟為：

(1)使用常用磷酸鹽緩沖液，反應溫度為20～60℃之間；孵育體系pH介于7～10.5之間；

(2)以1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯類衍生物作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；

(3)加入不同濃度的抑制劑并設置空白對照組，孵育5～30分鐘，并在水解產物達到定量限且底物轉化率在0.1～20％之間終止反應；

(4)定量測定單位時間內水解產物的熒光值并計算加入抑制劑組對熒光值減少的百分數作為抑制活性評估標準。

7.按照權利要求2～6中任意項所述羧酸酯酶2的近紅外熒光探針底物的應用，其特征在于：應用于重組表達的CE2酶、含有CE2的細胞及組織制備物生物樣品中CE2活性的定量測定。