[發(fā)明專利]一種monellin蛋白突變體及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610087481.3
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105566471A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉波;蔡成固
• 申請（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/81
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白突變體技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種monellin蛋白突變體及其制備 方法。

背景技術(shù)

甜味蛋白monellin是西非植物Dioscoreophyllumcumminsii中提取的一種天然 甜味劑，具有強(qiáng)烈的甜味，甜度在相同條件下約為相同質(zhì)量蔗糖的3000倍，天然的monellin 蛋白是由兩條不同的肽鏈通過共價鍵結(jié)合在一起，由A鏈和B鏈組合而成，研究發(fā)現(xiàn)天然的 monellin蛋白在高溫下易失去活性，1989年Kim等人通過基因工程方法將兩條肽鏈結(jié)合成 一條蛋白鏈，使其熱穩(wěn)定性得到大大提升，在寬范圍PH下保持穩(wěn)定，同時其甜度未發(fā)生太大 變化。由于本身不含糖分，可以作為糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有 效的預(yù)防兒童齲齒的發(fā)生，具有非常大的市場潛力。單鏈monellin蛋白在65℃下處理就會 失去活性，使其在生產(chǎn)和運(yùn)輸過程中受到了限制。

單鏈monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表達(dá)成功，如大腸桿菌表達(dá) 系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、但是由于這些表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量和有毒代謝物質(zhì) 的問題使得monellin蛋白無法大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。采用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母發(fā)酵使得monellin 蛋白產(chǎn)量得到很大提升，但是由于有毒物質(zhì)甲醇的加入，發(fā)酵產(chǎn)品安全問題成為隱患。

另外如何將目的蛋白直接分泌到胞外，節(jié)省后期純化成本，且在發(fā)酵過程中不添 加誘導(dǎo)劑，減少發(fā)酵過程中的染菌概率，另外還要避免有毒代謝物質(zhì)，保證了該蛋白作為食 品添加劑的安全，是本發(fā)明需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種monellin蛋白突變體及其制 備方法。本發(fā)明對單鏈monellin進(jìn)行了定點(diǎn)突變，得到一種熱穩(wěn)定性突變體，并在畢赤酵母 中成功表達(dá)，解決了甜味蛋白在生產(chǎn)運(yùn)輸中易降解的技術(shù)難題；同時增加了蛋白甜度，使得 在其少量情況下就就能達(dá)到良好的甜味效果，為該甜味蛋白大規(guī)模工業(yè)化市場化打下堅(jiān)實(shí) 基礎(chǔ)。采用PGAPZαA質(zhì)粒可以將目的蛋白直接分泌到胞外，節(jié)省了后期純化成本，由于本身 為GADPH自誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)酵過程中不需要添加任何誘導(dǎo)劑，減少了發(fā)酵過程中的染菌概 率，同時沒有任何有毒代謝物質(zhì)，保證了該蛋白作為食品添加劑的安全。

本發(fā)明的一種monellin蛋白突變體及其制備方法技術(shù)方案為，一種monellin蛋白 突變體，將野生型單鏈monellin基因第2位氨基酸谷氨酸(Glu)定點(diǎn)突變?yōu)樘於０?Asn)。

甜度相對于野生單鏈monellin蛋白提升3倍。

熱穩(wěn)定性相對于野生單鏈monellin蛋白提升10℃。

所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建野生型單鏈monellin蛋白表達(dá)載體；

(2)將步驟(1)中進(jìn)行定點(diǎn)突變得到突變基因，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測序驗(yàn)證；

(3)將步驟(2)中測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，篩選出成功轉(zhuǎn)化的畢赤酵 母；

(4)在YPD培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，時間為3天；

(5)將步驟(4)中表達(dá)的蛋白純化。

步驟(1)為，構(gòu)建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒PGAPZαA。

步驟(2)突變位點(diǎn)特異性引物：上游P1：[5’- CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTAACTGGGAG-3’]；下游P2：[5’- TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。

步驟(2)中，用Xhol和NotI內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物并與酶切后的PGAPZαA空載體連接， 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固體培養(yǎng)基上，過夜培 養(yǎng)挑取陽性單菌落并提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證突變結(jié)果，構(gòu)建突變質(zhì)粒PGAPZαA-E2N將正確的突 變質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?

步驟(3)中所述的畢赤酵母為畢赤酵母GS115。