[發明專利]一種monellin蛋白突變體及其制備方法

在審

• 申請號: 201610087481.3
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105566471A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 劉波;蔡成固
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/81
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 于曉曉

1.一種monellin蛋白突變體，其特征在于，將野生型單鏈monellin基因第2位氨基酸谷 氨酸(Glu)定點突變為天冬酰胺(Asn)。

2.根據權利要求1所述的一種monellin蛋白突變體，其特征在于，甜度相對于野生單鏈 monellin蛋白提升3倍。

3.如權利要求1所述利用定點突變方法得到的突變蛋白其特征在于：熱穩定性相對于 野生單鏈monellin蛋白提升10℃。

4.如權利要求1所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟：

(1)構建野生型單鏈monellin蛋白表達載體；

(2)將步驟(1)中進行定點突變得到突變基因，挑取陽性轉化子測序驗證；

(3)將步驟(2)中測序正確的質粒轉化入畢赤酵母中，篩選出成功轉化的畢赤酵母；

(4)在YPD培養基中誘導表達蛋白，時間為3天；

(5)將步驟(4)中表達的蛋白純化。

5.根據權利要求4所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(1) 為，構建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達質粒PGAPZαA。

6.根據權利要求5所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(2) 突變位點特異性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTAACTGGGAG-3’]；下游 P2：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。

7.根據權利要求6所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，用XhoI和NotI內切酶消化PCR產物并與PGAPZαA空載體連接將后轉化入大腸桿菌DH5α感 受態細胞中，涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固體培養基上，過夜培養挑取陽性單菌落并提 取質粒，測序驗證突變結果，構建突變質粒PGAPZαA-E2N將正確的突變質粒保存備用。

8.根據權利要求7所述的一種monellin蛋白突變體的制備方法，其特征在于，步驟(3) 中所述的畢赤酵母為畢赤酵母GS115。