[發(fā)明專利]一種豬生殖干細胞體外分化精子的建立方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610087392.9
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105624101A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 白銀山;張守全;朱翠;馮美瑩;衛(wèi)恒習;李莉
• 申請（專利權）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發(fā)明屬于成體干細胞研究技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一 種豬生殖干細胞體外分化精子的建立方法。

背景技術

雄性生殖干細胞(malegermlinestemcells,mGSCs)是一類特殊 的成體干細胞，它存在睪丸組織內(nèi)，維持數(shù)量恒定，又可以源源不斷 的分化產(chǎn)生精子，是生殖發(fā)育研究的主要內(nèi)容之一。

精子有序的分化，是雄性動物維持生育能力的關鍵，體外誘導 mGSCs和其他類型干細胞向精子分化的研究已開展很多年，但成功 建立體外誘導mGSCs發(fā)育到功能精子的報道還很少。目前，大部分 研究在人和小鼠上開展，但仍然還存在成功率不高，可操作性不強的 現(xiàn)象，大動物的精子分化研究還并未不多。

在成年動物睪丸中，成熟的支持細胞，生精小管的類肌細胞和生 精小管之間的間質空間內(nèi)存在的各級間質細胞以及其中的血管和淋 巴管，是構成mGSCs微環(huán)境(“龕”，“Niche”)的重要組成部分，這 個“Niche”調(diào)控著mGSCs增殖和分化，是mGSCs自我更新和分化平 衡的保障。

目前，體外誘導精子分化的技術，成為人類輔助生殖、瀕危物種 保護和轉基因動物研究的一項重要亟待解決的技術。體外模擬睪丸組 織內(nèi)的“Niche”，是建立精子體外分化的突破點，日本生殖生物學家 TakehikoOgawa將摘除新出生兩三天的幼鼠的睪丸，放置到一個含有 專用培養(yǎng)基皿中體外組織培養(yǎng)，建立精子分化所需的體內(nèi)“Niche”， 移植進入的mGSCs可以在體外分化成正常功能的精子。成為體外誘 導精子分化研究的一個新方法。

精子發(fā)生過程相當復雜，不同物種之間也展現(xiàn)出了很大的差異， 豬和小鼠的精子發(fā)生過程相一致，呈現(xiàn)多步驟分化，而人和靈長類動 物精子分化步驟要明顯少于小鼠和豬的精子分化過程。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供了一種構建 體外誘導精子分化的“Niche”飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基、支持豬mGSCs體外精 子分化的培養(yǎng)基、以及豬mGSCs體外分化精子的建立方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術方案：

一種構建體外誘導精子分化的“Niche”飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基，所述培 養(yǎng)基為含12-15％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺， 1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％1Penicilin-Stretomycin 的DMEM培養(yǎng)基。

一種支持豬mGSCs體外精子分化的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為含 10-12％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷 酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％Penicilin-Stretomycin的DMEM 培養(yǎng)基。

一種豬mGSCs體外分化精子的建立方法，包括以下步驟：

(1)、仔豬睪丸組織經(jīng)分離培養(yǎng)，獲取原代仔豬睪丸組織成纖維 細胞和mGSCs；

(2)、采用培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(1)的成纖維細胞組織15天，構建 得到體外誘導精子分化的“Niche”飼養(yǎng)層；所述培養(yǎng)基為含12-15％ FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mL LH，500ng/mlFSH和1％Penicilin-Stretomycin的DMEM培養(yǎng)基；

(3)、將步驟(1)的mGSCs接種至步驟(2)的“Niche”飼養(yǎng)層， 培養(yǎng)27～30天，經(jīng)細胞生物學分析，體外獲得單倍體精子樣細胞。

在其中一些實施例中，步驟(1)中仔豬睪丸組織經(jīng)通過酶消化 法和貼壁法分離培養(yǎng)，獲取原代仔豬睪丸組織成纖維細胞和mGSCs。

在其中一些實施例中，步驟(3)中所述mGSCs停止自我更新， 開始分化，采用含10-12％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L- 谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和 1％Penicilin-Stretomycin的DMEM培養(yǎng)基與“Niche”飼養(yǎng)層對mGSCs 進行共培養(yǎng)。

在其中一些實施例中，步驟(3)中所述細胞生物學分析為細胞 形態(tài)觀察、染色體倍型分析、減數(shù)分裂進程分析和精子基因檢測。

在其中一些實施例中，步驟(3)中培養(yǎng)30天。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：