[發(fā)明專利]一種豬生殖干細胞體外分化精子的建立方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610087392.9
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105624101A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白銀山;張守全;朱翠;馮美瑩;衛(wèi)恒習;李莉
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種構(gòu)建體外誘導(dǎo)精子分化的“Niche”飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基，其特 征在于，所述培養(yǎng)基為含12-15％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS， 1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％ Penicilin-Stretomycin的DMEM培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體外誘導(dǎo)精子分化的“Niche”飼養(yǎng) 層的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含15％FBS，55μMβ-巰基 乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH 和1％Penicilin-Stretomycin的DMEM培養(yǎng)基。

3.一種支持豬生殖干細胞體外精子分化的培養(yǎng)基，其特征在于， 所述培養(yǎng)基為含10-12％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷 氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％ Penicilin-Stretomycin的DMEM培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的支持豬生殖干細胞體外精子分化的培 養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含10％FBS，55μMβ-巰基乙醇， 1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和 1％Penicilin-Stretomycin的DMEM培養(yǎng)基。

5.一種豬生殖干細胞體外分化精子的建立方法，其特征在于， 包括以下步驟：

(1)、仔豬睪丸組織經(jīng)分離培養(yǎng)，獲取原代仔豬睪丸組織成纖維 細胞和生殖干細胞；

(2)、采用權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建體外誘導(dǎo)精子分化的“Niche” 飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(1)的睪丸組織成纖維細胞15天，構(gòu)建得 到體外誘導(dǎo)精子分化的“Niche”飼養(yǎng)層；

(3)、將步驟(1)的生殖干細胞接種至步驟(2)的“Niche”飼養(yǎng) 層，培養(yǎng)27～30天，經(jīng)細胞生物學分析，體外獲得單倍體精子樣細胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬生殖干細胞體外分化精子的建立方 法，其特征在于，步驟(3)中所述生殖干細胞停止自我更新，采用 含10-12％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％ 核苷酸，1ng/mLLH，500ng/mlFSH和1％Penicilin-Stretomycin的 DMEM培養(yǎng)基與“Niche”飼養(yǎng)層對生殖干細胞進行共培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬生殖干細胞體外分化精子的建立方 法，其特征在于，步驟(3)中體外持續(xù)培養(yǎng)至30天。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬生殖干細胞體外分化精子的建立方 法，其特征在于，步驟(3)中所述細胞生物學分析為細胞形態(tài)觀察、 染色體倍型分析、減數(shù)分裂進程分析和精子基因檢測。

9.根據(jù)權(quán)利要求5～8任一項所述的豬生殖干細胞體外分化精子 的建立方法，其特征在于，步驟(1)中仔豬睪丸組織經(jīng)通過酶消化 法和貼壁法分離培養(yǎng)，獲取原代仔豬睪丸組織成纖維細胞和生殖干細 胞。