[發明專利]一種基因敲除選育stat1a基因缺失型斑馬魚的方法

有效

• 申請號: 201610086190.2
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105594664B
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 陳湘定;蘇幸;熊玖玲;鄧云;鄧紅文
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/6888;A01K67/027
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所(普通合伙) 43205
• 代理人: 許伯嚴

一種stat1a基因缺失型斑馬魚，其實驗設計區敲除后序列如SEQ ID No.1所示，由如下步驟構成：CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設計：構建gRNA表達載體以及gRNA體外合成；斑馬魚胚胎的顯微注射；T7E1法和Sanger測序檢測靶位點的有效性；注射兩個月之后，進行剪尾鑒定，同上鑒定步驟；目的序列的TA克隆；質粒的Sanger測序；獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代；獲得斑馬魚突變體的F2代純合子,依據上述方法進行該基因缺失型斑馬魚的F3代純系遺傳，得到這種新的斑馬魚品系。

技術領域

本發明屬于基因敲除技術領域，涉及一種stat1a基因缺失型斑馬魚。

背景技術

STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)基因位于人類2q32.3，是編碼750個氨基酸的轉錄因子。一般認為該基因介導干擾素信號通路，可直接調控靶基因的轉錄，并參與細胞增殖與分化等過程。通過基因差異表達譜分析和基因組關聯分析等，發現STAT1基因與骨質疏松密切相關。

斑馬魚與人類在骨骼發育過程中的基因、信號通路有高度同源性，且STAT1 基因進化上較為保守，人類STAT1基因的兩個不同剪接體STAT1-alpha和 STAT1-beta對應于斑馬魚兩個不同基因stat1a和stat1b，研究發現stat1a在斑馬魚胚胎早期表達量特別高。而且，與其他動物模型相比，斑馬魚個體小、幼魚通體透明，利于骨骼發育的觀察。

通過CRISPR/Cas9基因打靶技術，在斑馬魚stat1a基因上設計合適的打靶位點，將體外合成的特異性sgRNA(終濃度20ng/μL)和Cas9-mRNA(終濃度300 ng/μL)顯微共注射進斑馬魚一細胞內，并通過活性檢測證實了所選位點的有效性。

基因打靶技術起源于20世紀80年代末，是一種通過對基因組進行定點修飾來研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治療人類的各種遺傳性疾病。該技術主要是利用缺失突變、基因滅活、染色體大片段刪除以及外源基因導入等方式來改變生物的遺傳信息，并且在生殖系中穩定遺傳后表達突變性狀，從而研究生物體內特定基因在生長發育過程中的作用，所以這類技術手段已成為現代分子生物學研究熱點。傳統的基因打靶技術是建立在胚胎干細胞(ESC)和同源重組技術的基礎之上，故打靶技術效率極低。2013年初，一種全新的人工核酸內切酶 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡單、成本低，且可同時對靶基因上多個位點進行剪切，沉默任意數目的單個基因，但同時該技術存在一定的缺陷，其脫靶率相對較高。

基于此提供一種stat1a基因缺失型斑馬魚，提高對statla基因的研究同時增加斑馬魚的商業價值就顯得尤為必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種stat1a基因缺失型斑馬魚。本發明方法中，stat1 基因涉及細胞的生長，分化、凋亡和免疫的基因表達。研究發現stat1a基因和骨骼的發育相關，本發明方法，可用于進行stat1a基因與骨骼發育的相關研究，也可進項其他方面探索研究，檢測stat1a基因的缺失與其他器官的發育是否具有相關性，例如心臟等，具有很好的醫學研究價值，同時敲除stat1a基因的斑馬魚其成長周期明顯縮短，也具有很好的商業價值。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案為：

一種stat1a基因缺失型斑馬魚，所述斑馬魚stat1a基因缺失實驗設計區敲除后序列如SEQ ID No.1所示。

進一步的，一種stat1a基因缺失型斑馬魚由如下步驟構成：

步驟一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設計：