[發明專利]一種基因敲除選育stat1a基因缺失型斑馬魚的方法

有效

• 申請號: 201610086190.2
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105594664B
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 陳湘定;蘇幸;熊玖玲;鄧云;鄧紅文
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/6888;A01K67/027
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所(普通合伙) 43205
• 代理人: 許伯嚴

1.一種基因敲除選育stat1a基因缺失型斑馬魚的方法，其特征在于，所述斑馬魚stat1a基因缺失實驗設計區敲除后序列如SEQIDNo.1所示，該斑馬魚由如下步驟得到：

步驟一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設計：

在NCBI上查詢斑馬魚stat1a基因的基因組DNA序列及其功能結構域，根據CRISPR/Cas敲除原理，設計一對stat1a基因的靶位點，靶點的選擇遵循此標準：5’-GG-(N)18-NGG-3’；其中5’端的GG二核苷酸是T7啟動子的一部分，靶位點的3’端是NGG；

步驟二、構建gRNA表達載體以及gRNA體外合成：

(1)首先將gRNA骨架克隆到p42250載體上，取1-2μL質粒進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(2)特異性gRNA體外合成

用BsaI限制性內切酶線性化此質粒；酶切反應總體積為20μL，體系如下：

離心混勻后于37℃水浴，酶切2h以上；

(3)以線性化的p42250載體為模板，通過下面特異性引物進行PCR，擴增出用于特異性gRNA合成的雙鏈DNA；

PCR引物上下游引物分別位于1號和3號內含子上：

F：5’-CAGAAATCGGGGGAAAAATATAC-3’

R：5’-TGCTGTTGTACCATGGCTATACTT-3’

正向引物F：T7啟動子_20bp靶序列_20bpgRNA上游骨架

反向引物R：20bpgRNA下游骨架

PCR反應體系如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進行擴增反應；反應條件為：預變性95℃8min，其中變性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s進行30個循環，再72℃8min；待反應結束后，離心PCR產物，取1μL樣品點樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統拍攝結果；

(4)檢測確定條帶正確之后，進行瓊脂糖凝膠DNA回收，純化回收PCR產物；

(5)測定純化之后的DNA濃度，再以此DNA為模板，用20μL體系進行體外轉錄，合成特異性gRNA；轉錄實驗中所用Tip頭，EP管均為DEPC處理過的RNase-Free產品，具體操作如下：

體外轉錄反應體系：

將反應物都加入1.5mLRNase-Free的EP管中，混勻之后，于37℃水浴1.5h；

水浴結束后，取1μL樣品，用配制好的2.0％的瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測轉錄結果，若轉錄產物大小與預期的相符，則說明轉錄成功；

向轉錄體系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴鍋中反應20min，用以消化DNA模板，再取1μL轉錄終產物，即gRNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測轉錄效率；

(6)特異性gRNA的純化

用RNeasyMinikit試劑盒純化轉錄成功的gRNA，保存于-20℃；吸取1μL溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗純化產物，并測定純化之后的gRNA濃度；

步驟三、斑馬魚胚胎的顯微注射，顯微注射體系如下：

在受精后30min之內，用吸管吸取胚胎轉移至用瓊脂糖制作的顯微注射專用培養皿中；

在進行顯微注射之前，將Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混勻，使Cas9mRNA的終濃度為300ng/μL，gRNA的終濃度為20ng/μL；注射1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一細胞期的受精卵內；注射過的受精卵放置于5mmol/LNaCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4，0.17mmol/LKCl的E3水中，28℃孵化；在體式顯微鏡下觀察胚胎表型，篩選正常發育的胚胎用于靶位點突變分析；

步驟四、T7E1法和Sanger測序檢測靶位點的有效性：

對斑馬魚胚胎進行顯微注射之后，挑選部分發育正常的早期胚胎，檢測其stat1a基因是否存在突變，提前確認此次選擇的靶位點是否有效果，顯微注射操作是否規范；

步驟五、注射兩個月之后，進行剪尾鑒定，同上鑒定步驟；

步驟六、目的序列的TA克隆：

T7E1酶切初步鑒定有突變可能的目的序列再進行Sanger測序；若測序峰圖有雙峰，并且測序結果顯示有插入或缺失現象的目的序列，接下來進行TA克隆之后挑取單克隆作進一步檢測；

步驟七、質粒的Sanger測序：

將雙酶切檢測結果顯示條帶大小符合預期結果的質粒送往測序，根據測序之后給出的峰圖和序列，在NCBI上與標準目的序列進行對比，根據比對結果，分析出每個單克隆的突變類型；

步驟八、獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代：

通過前面一系列篩選確定了斑馬魚突變體F0代，緊接著將F0代突變體分別與野生型斑馬魚雜交得到F1代胚胎，置于28℃培養，在初期觀察F1代的存活率；受精兩天后，每個突變體F1代分別取10個胚胎進行突變遺傳性鑒定；將每個胚胎單獨提取基因組，然后PCR擴增出700bp的靶位點附近區域，再進行T7E1酶切分析并送部分去測序，確定此突變是否可以遺傳到F1代；

如果從F1代胚胎中檢測到存在突變，則將斑馬魚突變體的F1代養大至2-3個月；再分別對每條F1代斑馬魚成魚進行剪尾，篩選F1代突變體；

步驟九、獲得斑馬魚突變體的F2代純合子：

從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F2代，放置于28℃培養，受精四天后取部分胚胎進行鑒定，將每個胚胎單獨提取基因組，PCR擴增出700bp靶位點附近區域，通過BalⅠ限制性酶切分析并測序，初步檢驗是否可以得到stat1a突變體純合子；如檢驗結果證明存在純合子，則養大后再單條剪尾鑒定；

步驟十、依據步驟九方法進行該基因缺失型斑馬魚的F3代純系遺傳，得到這種新的斑馬魚品系。

2.根據權利要求1所述的一種基因敲除選育stat1a基因缺失型斑馬魚的方法，其特征在于，所述步驟四的具體操作為：

(1)提取斑馬魚基因組

斑馬魚胚胎50hpf受精50小時后，分別收集野生型做對照和注射后胚胎于1.5mLEp管中，每管5只胚胎，按照下述方法提取基因組DNA，具體步驟如下：

向裝有胚胎的Ep管中加入400μL細胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴鍋中裂解2小時以上，期間每隔半小時，輕輕顛倒混勻，以保證胚胎被充分裂解完全；

裂解完成后，放在振蕩器上充分震蕩，加入等體積預先冷卻的異丙醇于Ep管中，充分顛倒混勻，于4℃條件下，12000×g離心10min，倒掉上清液；

加入75％乙醇500μL，于4℃條件下，12000×g離心5min，棄上清液，室溫風干20min；

加入60-100μL去離子水，充分吹打混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效率

(2)PCR擴增目的序列

提取基因組DNA之后，根據CRISPR靶位點上下游約150-200bp的基因組區域，利用PrimerPremier5.0軟件設計引物序列以擴增出目的DNA片段；

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進行擴增反應，反應條件為：預變性94℃2min，其中變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃23s共30個循環，再72℃2min；待反應結束后，離心PCR產物，取1μL樣品點樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測PCR產物大小是否正確；

(3)若PCR產物正確，則用2.0％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，在紫外下切下目的條帶，進行純化回收；

(4)T7核酸內切酶I法

用T7E1分析檢測是否存在突變，首先，取純化回收之后的DNA15μL裝于150μL的Ep管中，置于95℃熱水中進行變性，然后自然冷卻至室溫，再取變性之后的DNA進行T7E1酶切，體系如下：

混勻體系后，于37℃水浴鍋中酶切反應30min，再用2％的凝膠進行電泳，以檢測目的DNA片段是否被切開，如若目的DNA片段下面有被切開的條帶，則使用ImageJ軟件，通過酶切后條帶的亮度來估計非同源末端連接的頻率；

另外，送部分純化之后的目的DNA片段進行Sanger測序，由測序的峰圖來初步獲得插入或缺失的信息。