[發明專利]提高植物轉化效率的多個轉化增強子序列的應用

在審

• 申請號: 201610086188.5
• 申請日: 2007-07-18
• 公開（公告）號: CN105734079A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: X·葉;L·吉爾伯森
• 申請（專利權）人: 孟山都技術有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/82;C12N5/10;C12N1/21;A01H5/00;C12R1/41;C12R1/01
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;徐志明

發明背景

本申請要求獲得于2006年7月19日提交的美國臨時專利申請60/831,814的優先權，其公開通過引用全文結合到本文中。

1.發明領域

本發明主要涉及植物生物技術。更具體地說，本發明涉及提高細菌介導的植物轉化效率的方法和組合物。

2.相關技術描述

在天然的農桿菌(Agrobacterium)介導的植物細胞的轉化中，來自根瘤農桿菌(A.tumefaciens)的Ti質粒或者發根農桿菌(A.rhizogenes)的Ri質粒的一段DNA被轉移到植物細胞中(例如Gelvin,2003)。該被轉移的DNA(T-DNA)片段側翼是不完全的24bp正向重復序列，該重復序列可被農桿菌核酸內切酶VirD2識別，通過在每一重復序列的一條鏈上的特定位點上形成切口而產生單鏈的T鏈。引發單鏈的T鏈形成的重復序列稱為“右邊界”(RB)，而終止單鏈的T鏈形成的重復序列被稱為“左邊界”(LB)。形成切口后，VirD2蛋白連附著在所述鏈的5’端，并引導T鏈進入植物細胞，在其他農桿菌和植物編碼蛋白的幫助下T鏈被整合到植物基因組中。包含載體骨架序列在內的T-DNA區域的序列下游(從5’到3’方向)也可能被轉移(例如Kononov等，1997)。這有可能是由于在轉移到植物細胞之前農桿菌中至少一個邊界不能形成缺口所致。

通過比較多種農桿菌菌株的RB和LB序列，表明RB和LB享有共同的基序(Canaday等,1992)，這表明可能有其他元件參與RB加工效率的調節。鄰近RB的順式作用序列存在于許多農桿菌菌株中，包括根瘤農桿菌和發根農桿菌。這些序列對野生型侵入性而言是必需的(Veluthambi等，1988；Shurvington和Ream1991；Toro等，1989；Toro等，1988；Hansen等，1992)。在根瘤農桿菌中該序列被Peralta等(1986)稱為“超驅動(overdrive)”或者“T-DNA傳遞增強子”。在發根農桿菌中該序列被Hansen等(1992)稱為“T-DNA轉移激活序列(TSS)”。超驅動(“OD”)序列起始被定義為直接存在于章魚堿TiTL-DNA的RB重復序列之前的特定24bp基序(Peralta等，1986)。類似的序列存在于章魚堿TiTR-DNA的RB重復序列之前，并且也存在于胭脂堿TiRB和農桿堿RiTL右邊界之前(Peralta等，1986、Shaw等，1984、Barker等，1983、Slighton等，1985)。進一步比較不同根瘤農桿菌顯示8bp的超驅動核心序列存在于所有右邊界序列之前，那些菌株包括胭脂堿菌株pTiT37、章魚堿菌株pTiA6和發根農桿菌pRiA4(Peralta等，1986)。

章魚堿超驅動序列的存在增強農桿菌細胞中單鏈T-DNA的形成，促進T-DNA轉移到植物細胞中，并且對野生型侵入性是必需的(Peralta等，1986,Shurvinton和Ream1991)。當將pTiT37(產生胭脂堿的Ti質粒)RB近端的順式作用序列放置在pTiT37的LB重復序列之前時，后者能夠產生高效的單鏈T-DNA，這表明類似超驅動的序列確實也存在于胭脂堿Ti質粒上(Culianez-Macia和Hepburn1988,Peralta等，1986)，正如其在其他鑒定的(產生章魚堿的)Ti質粒中一樣。使異源的章魚堿超驅動序列整合到胭脂堿pTiT37RB之前，導致比僅包含一個合成pTiT37RB重復序列的親本菌株更大的侵入性(Peralta等，1986)。

VirC1蛋白結合到超驅動序列并且被認為可促進VirD2產生缺口(Toro等，1988,1989)，而virC突變導致了在植物中侵入性減弱(Close等，1987)和加工的單鏈T-DNA序列產量減少。根瘤農桿菌的章魚堿和胭脂堿Ti質粒皆包含virC并且可以與virC突變反式互補以使減弱的侵入性恢復到野生型水平(Close等，1987)。

在發根農桿菌菌株8196、A4和2659中發現的TSS與根瘤農桿菌中的超驅動序列起著相似的作用。每一種發根農桿菌菌株具有不同但相關的序列(Hansen等，1992)。8bp的TSS核心序列在pRiA4重復5次、在pRi8196中重復6次而在pRi2659(Genbank登錄號AJ271050)中重復17次(而不是Hansen等，1992中的16次)。除這些重復外pRiA4還具有保守的8bp超驅動核心序列。在pRiA4和pRi8196中更短的核心序列重復對于野生型侵入性而言是不足夠的(Hansen等，1992)。