[發明專利]檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的引物、檢測試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201610084545.4
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105463137A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 馬建忠;鄧子兵;王永剛;陳妤;王文銀;潘博;李印武
• 申請（專利權）人: 蘭州理工大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州智羚知識產權代理有限公司 33250
• 代理人: 劉芬豪

1.檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的引物，其特征在于：

SVBV4上游引物為CTAACTATCTTACACAGGGAAC，SVBV4下游引物為 GTCCGATCTCATTACAAATCCA；

SVBV6上游引物為ATCATACAAGAAGACCGCAAC，SVBV6下游引物為 TTTCACCACTCTAGCTGCCTC。

2.檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于：包括，

步驟一.設計的引物為：

SVBV4上游引物為CTAACTATCTTACACAGGGAAC，SVBV4下游引物為 GTCCGATCTCATTACAAATCCA；

SVBV6上游引物為ATCATACAAGAAGACCGCAAC，SVBV6下游引物為 TTTCACCACTCTAGCTGCCTC；

步驟二.提取草莓樣品的DNA，加入草莓樣品DNA、設計的引物以PCR 法進行樣品DNA的擴增和檢測；

PCR的擴增參數為：94℃預變性90s，30個循環包括94℃變性30s、50℃ 退火30s、72℃延伸40s，最后72℃延伸5min；每25μL體系中，草莓樣品DNA 的濃度為0.026-39ng/μl，引物濃度為0.4μM；

通過PCR反應體系進行瓊脂糖凝膠電泳，若電泳圖樣中含有以上兩個基因 的目的條帶確定草莓植株感染草莓鑲脈病毒；若電泳圖樣中不含有以上兩個基 因的目的條帶確定草莓植株沒有感染草莓鑲脈病毒。

3.根據權利要求2所述的檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于： 步驟一和步驟二同時進行。

4.根據權利要求2所述的檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于： 步驟二中，提取草莓樣品的DNA的方法：

A.65℃預熱CTAB提取液；

B.取1g的草莓嫩葉片在液氮中研碎，轉入離心管，隨后加500μl已預熱的 CTAB提取液，得混合液I；在65℃水浴鍋中保溫45min，期間顛倒至少一次；

C.用與混合液I等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液抽提1次，期間顛倒至少一 次，離心取上清液；

D.重復操作步驟C；

E.取上清液，加預冷過的異丙醇，異丙醇的體積為上清液體積的0.6-1倍， -20℃放置20min，離心棄上清液，用70％乙醇洗滌兩次沉淀，待乙醇揮發后進 行下一步；

F.加入40μl無菌水或TE緩沖液溶解沉淀，加RNA酶至濃度為500U/μl， 得到的草莓樣品的DNA，放入-20℃保存備用。

5.根據權利要求4所述的檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于： 步驟A中，CTAB提取液中含質量濃度為2‰的β-巰基乙醇。

6.根據權利要求4所述的檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于： 步驟C中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚、氯仿、異戊醇的體積比為25∶24∶1。

7.根據權利要求4所述的檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于： 步驟C中，12000r/min離心10min，取上清液；

8.根據權利要求4所述的檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的方法，其特征在于： 步驟E中，8000r/min離心5min。

9.檢測草莓是否感染草莓鑲脈病毒的檢測試劑盒，其特征在于：包括SVBV4 上游引物為CTAACTATCTTACACAGGGAAC，SVBV4下游引物為 GTCCGATCTCATTACAAATCCA；

SVBV6上游引物為ATCATACAAGAAGACCGCAAC，SVBV6下游引物為 TTTCACCACTCTAGCTGCCTC。