[發明專利]一種微藻胞內代謝物樣品提取方法

有效

• 申請號: 201610083257.7
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN107044928B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 薛松;曹旭鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開了一種微藻胞內代謝物樣品提取方法，使用冰浴方式迅速失活胞內酶，通過二氯甲烷或者氯仿超聲破碎，以二氯甲烷(或氯仿)：甲醇：水三相體系進行快速極性、非極性化合物、不溶性糖和蛋白的分離，用于后續代謝組學分析。本發明具有操作步驟少，可同時測定極性和非極性胞內組分的特點。

技術領域

本發明涉及一種微藻胞內代謝物樣品提取方法。

背景技術

微藻為自養型微生物，因其細胞內存在光合作用系統也稱為微藻植物。微藻具有高效吸收太陽能、固定二氧化碳產生生物質的能力(即光合作用能力)；同時微藻作為微生物的一種，其增殖速度較快。作為單細胞生物，微藻的主要組成為蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已經是重要的養殖餌料被養殖企業廣泛應用，同時微藻也已經成為類胡蘿卜素、蛋白質、多糖等保健食品的來源。隨著化石能源枯竭的預期加劇，微藻在能源制品和精細化學品的潛在應用也得到了極大關注。為了有效利用微藻生物資源，或將微藻作為細胞工廠而定向調控微藻，微藻胞內代謝物分析都在其中起了重要作用。越來越多的研究表明，在代謝物研究過程中，樣品提取方法對后期結果有很大的營養，一方面，胞內酶系的存在，有可能在樣品處理過程中產生內源性轉化，使得結果偏離預期，另一方面，不同極性和溶解性物質的存在，大多現有方法會丟失一部分樣品，降低了樣品的利用率，或操作復雜，耗時長(CN102472741B，CN103713075A，CN102495152B和CN102517349B)。

針對內源性降解，常用的方法包括低溫失活、低溫溶劑失活或高溫溶劑失活幾種。對于微藻來說，其培養體系為水環境，干基生物質質量含量通常在千分之幾水平，因此現有方法是先離心再失活處理。盡管4℃離心時間僅有幾分鐘，但是該過程中細胞仍具有一定的活性。比較好的方法應先使胞內酶失活再進行生物質收集。離心收集的微藻生物質含水量在10-90％之間。

常規提取方法中，樣品收集后會采用冷凍干燥進行水分的去除。但是無論是對極性物質的水提，還是利用有機溶劑進行抽提，通常提取劑的用量會遠遠高于離心收集到微藻細胞沉淀中的水量，后者對于大多數后續測定不產生實質影響。

同時，在常規提取方法中，多僅選擇性收集其中一相進行后續分析，如果能夠對多個組分進行分析，能夠從有限的樣品中獲得更多的信息。

因此，本發明基于上述分析，針對微藻代謝物研究，尤其是組學層次研究特點，提出了一種新的胞內代謝物樣品制備流程。

發明內容

本發明涉及一種用于微藻代謝胞內代謝物樣品制備的方法，首先通過低溫冰浴失活胞內酶，再離心收集細胞，并在二氯甲烷或者氯仿中超聲破碎細胞，使用含有甲醇的水相進行代謝物分離，獲得可溶的極性(水相)、非極性(溶劑相)和不溶的多糖及蛋白組分，用于后續的代謝組學研究。具體操作如下：

(1)冰浴失活胞內酶。將經過0.22微米濾膜過濾除菌的微藻培養基或與待處理微藻胞內滲透壓相當的等滲溶液，于15mL或50mL離心試管中存放于-80℃冰箱中，制備冰斜面。所使用的培養基或者等滲溶液最多不超過離心試管體積的一半。將待分析的微藻培養液直接加入到冰斜面上，體積不超過冰斜面所用溶液的體積。劇烈振蕩直至冰剛剛融化消失。

(2)離心收集細胞。將(1)中的細胞懸液迅速轉移至遇冷的4℃離心機中，在2000～12000g轉速下離心5～10分鐘，收集細胞，棄上清。

(3)細胞清洗。將收集的藻細胞用與經過預冷至4℃的、取樣時藻液體積相同的(1)中0.22微米濾膜過濾除菌的溶液重懸后，按照(2)條件離心收集細胞，棄上清。重復該步操作2～3次。最終獲得的細胞沉淀可以保存于-80℃或者直接進行步驟(4)的操作。

(4)超聲破碎。按照初始每2～8mg細胞加入2mL二氯甲烷或者氯仿的比例，加入到所收集的細胞沉淀中，在冰水混合物中進行超聲破碎。以2mL上述體系為例，超聲功率300-500w，按照超聲5～8s，停止5～15s間隔循環操作至溶液中無肉眼可見細胞聚集體。