[發明專利]一種微藻胞內代謝物樣品提取方法

有效

• 申請號: 201610083257.7
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN107044928B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 薛松;曹旭鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種用于微藻代謝胞內代謝物樣品制備的方法，其特征在于，具體操作如下：

(1)冰浴失活胞內酶：將微藻液體培養基或與待處理微藻胞內滲透壓相當的等滲溶液，于離心試管冷凍制備冰斜面；所使用的培養基或者等滲溶液體積為最多不超過離心試管體積的一半；取出離心試管，將待分析的微藻培養液直接加入到冰斜面上，體積不超過冰斜面所用溶液的體積；劇烈振蕩直至離心試管內冰剛剛融化消失，得細胞懸液；

(2)離心收集細胞：將(1)中的細胞懸液迅速轉移至預冷的-4至4℃離心機中，在2000～12000g轉速下離心5～10分鐘，收集細胞，棄上清；

(3)細胞清洗：將收集的藻細胞用與待分析的微藻培養液體積相同的步驟(1)中制備冰斜面的溶液重懸后，按照步驟(2)條件離心收集細胞，棄上清，進行細胞清洗；其中，制備冰斜面的溶液需要預冷至-4至4℃；重復該步操作1～3次；最終獲得的細胞沉淀可以保存于-80℃或者直接進行步驟(4)的操作；

(4)超聲破碎：按照每1x10⁸～3x10⁸個細胞加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的比例，將二氯甲烷和/或氯仿加入到所收集的細胞沉淀中，在-4至4℃冰水混合物中進行超聲破碎，按照超聲5～8s，停止5～15s間隔循環操作至溶液中無肉眼可見細胞聚集體；

(5)萃取：對應于上述每加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的步驟(4)體系，再加入1mL0～4℃預冷的甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇和水的體積比1:3～1:5，體系中甲醇水溶液與二氯甲烷和/或氯仿溶液的體積比為1:2，充分混合，0～4℃靜置5～10分鐘至體系明顯分層，4℃，12000g離心10分鐘，獲得三相分層體系，其中上層為水相，下層為有機相，中間固形物層；將上述三相分別取出，即可用于后續分析。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：于所述二氯甲烷和/或氯仿中、以及萃取使用的甲醇水溶液中的一種或二種以上溶液內，可以根據需要加入內標物。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于：水相內標物可以是同位素標記的氨基酸、核酸、葡萄糖衍生物、甘油衍生物或待檢測的目標分子中的一種或二種以上；有機相內標物可以是同位素標記的脂肪酸或待檢測的目標分子中的一種或二種以上。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻是真核微藻或是原核的藍藻。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)將經過0.22微米濾膜過濾除菌的微藻培養基或與待處理微藻胞內滲透壓相當的等滲溶液，于15mL或50mL離心試管中存放于-80℃冰箱中，制備與水平方向成15-75度的冰斜面；所使用的培養基或者等滲溶液體積為離心試管體積的1/20至1/2；取出離心試管，將待分析的微藻培養液直接加入到冰斜面上，體積與冰斜面所用溶液體積之比為1/20至1；劇烈振蕩直至離心試管內冰剛剛融化消失。

6.如權利要求1或5所述的方法，其特征在于：

對于淡水藻，其等滲溶液為生理鹽水或30～50mM磷酸緩沖液；

對于海水藻，其等滲溶液為質量體積(g/ml)濃度為2.5～3.0％食鹽水；

等滲溶液的pH需調整與微藻培養條件一致。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)的操作；以2mL上述體系為例，超聲功率300-500w，按照超聲5～8s，停止5～15s間隔循環操作至溶液中無肉眼可見細胞聚集體。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(5)獲得三相分層體系，其中上層為水相，其中主要是極性分子；下層為有機相，其中主要是非極性分子，中間固形物層，其為多糖和蛋白質。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述后續分析是指包括重量法測定各組分重量，和/或下述分析方法中的一種或二種以上；

或利用薄層色譜、柱層析、氣相色譜、液相色譜或色譜-質譜聯用方法測定有機相代謝物；

或利用液相色譜或色譜-質譜聯用方法或衍生化后通過氣相色譜或色譜-質譜聯用方法測定水相代謝物；

或利用酶解、消化方法處理后測定中間固形物中糖的構成以及氨基酸或多肽的構成。