[發明專利]以miR-155前體為模板制備RNA探針的方法

在審

• 申請號: 201610083241.6
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105586335A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 徐學明;魯隼;馮俊清
• 申請（專利權）人: 廣州復能基因有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明屬于核酸診斷領域，具體涉及一種以miR-155前體為模板制備RNA 探針的方法及其應用。

背景技術

熒光原位雜交技術(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是一種重要的 非放射性原位雜交技術，熒光染料標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA 或RNA分子雜交，如果被檢測的染色體靶DNA與所用的核酸探針是同源互補 的，二者經變性-退火-復性，由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線 性排列，因而探針可以直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。 通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，以確定與特異探針雜交后結合了熒光探針的 DNA區域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位，對待測DNA進行定性、 定量或相對定位分析。

熒光原位雜交技術(FISH)具有很多優點，無需放射性同位素標記，安全 性較高；FISH的實驗周期短，探針穩定性強；通過多次免疫化學反應，使其雜 交信號放大，提高靈敏度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交；FISH的分辨率 高達3-20Mb；FISH可以用不同修飾核苷酸分子標記不同的探針，即可以制備成 多色探針。

FISH技術已經在基因定位、基因作圖、基因擴增和缺失的檢測、產前診斷、 哺乳動物染色體進化研究等領域得到了廣泛應用，特別是在腫瘤診斷方面，FISH 技術被廣泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等實體瘤的早期診斷、療效檢測、 個體化治療和預后判斷等幾個方面。cRNA探針比cDNA探針有更多的優勢：避 免了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間易復性的可能性，提高了雜交反 應的敏感性；cRNA與RNA之間形成的雜交體比cDNA-RNA雜交體更穩定；且 cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響，因此雜交反應后可用RNA 酶處理，以除去未結合的探針，可降低本底信號的影響。

制備特異性強、靈敏度高和穩定性強的腫瘤檢測探針，生產易保存和運輸相 關試劑及試劑盒，對腫瘤早期診斷和治療至關重要。研發出用于診斷和治療多種 腫瘤的高品質探針及相關試劑盒，不僅能提高人民的健康水平，而且具有很大的 經濟效益、社會效益及廣闊的市場前景。

miRNA是內源性的非編碼RNA分子，由長約18～25個核苷酸組成的單鏈 RNAs，呈高度保守性、時序表達特異性以及組織表達特異性，是參與腫瘤發生 和發展的重要致病因子，在實體惡性腫瘤以及血液系統腫瘤發病過程中起著重要 的作用。miRNAs具有腫瘤的抑癌基因與癌基因的雙重作用，參與了生物體的發 育、增殖、分化和凋亡等方面的調控。miRNAs對其靶基因的轉錄后表達調節非 常重要，當miRNAs和靶向mRNA完全或幾乎完全互補時，導致目的mRNA的 降解，當miRNAs和靶向mRNA不完全互補時，則負調控翻譯過程，阻礙蛋白 質翻譯。

胰腺癌是惡性程度比較高的消化系統疾病，其起病隱匿、早期發現困難，一 旦發現多屬晚期，失去手術時機，能施行手術的患者只有15％-20％。目前，手 術切除是胰腺癌治療的唯一根治療法，但因其早期即可發生浸潤和轉移，導致胰 腺癌手術切除治愈率低。

胰腺癌腫瘤標記物的診斷則包括許多方面，如血清類腫瘤標記物、癌胚腫瘤 標志物、基因類腫瘤標志物及其他幾十種胰腺癌相關基因和它們表達的蛋白質、 生長因子、黏附分子等。但上述標記物檢測時均有不足之處，故需尋找更多的生 物標記，而近年來miRNA在胰腺癌診斷中的運用是人們關注的熱點。胰腺癌的 早期診斷和早期治療確實能提高胰腺癌患者的生存率。因此，制備出胰腺癌的早 期診斷相關miRNARNA檢測探針至關重要。