[發明專利]以CA19-9 cDNA片段為模板制備RNA探針的方法

有效

• 申請號: 201610083165.9
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105567845B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 徐學明;魯隼;馮俊清
• 申請（專利權）人: 廣州復能基因有限公司
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811;C12Q1/6886;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發明提供了一種以CA19?9 cDNA為模板制備RNA探針的方法。該方法包括以下步驟：針對CA19?9 mRNA序列篩選多個靶序列，對于每個靶序列設計至少一對引物，所述引物的PCR擴增產物為多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；從CA19?9 cDNA質粒中，采用上述引物，通過PCR擴增得到所述多重DNA片段，純化后混合，作為模板；加入RNA聚合酶和帶有生物素標記的UTP進行反應，將UTP摻入產物，純化后得到RNA探針。本發明得到的cRNA探針能夠全部覆蓋所有靶序列，簡化了探針制備步驟，大幅度縮短整個實驗時間，探針特異性更高，穩定性更強，背景信號更低且靈敏度更高。在此基礎上，本發明提供了一種快速檢測胰腺癌相關的CA19?9表達的試劑盒。

技術領域

本發明屬于核酸診斷領域，具體涉及一種以CA19-9cDNA片段為模板制備RNA探針的方法及其應用。

背景技術

熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一種重要的非放射性原位雜交技術，熒光染料標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA或RNA分子雜交，如果被檢測的染色體靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-復性，由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可以直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，以確定與特異探針雜交后結合了熒光探針的DNA區域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位，對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

熒光原位雜交技術(FISH)具有很多優點，無需放射性同位素標記，安全性較高；FISH的實驗周期短，探針穩定性強；通過多次免疫化學反應，使其雜交信號放大，提高靈敏度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交；FISH的分辨率高達3-20Mb；FISH可以用不同修飾核苷酸分子標記不同的探針，即可以制備成多色探針。

FISH技術已經在基因定位、基因作圖、基因擴增和缺失的檢測、產前診斷、哺乳動物染色體進化研究等領域得到了廣泛應用，特別是在腫瘤診斷方面，FISH技術被廣泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等實體瘤的早期診斷、療效檢測、個體化治療和預后判斷等幾個方面。cRNA探針比cDNA探針有更多的優勢：避免了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間易復性的可能性，提高了雜交反應的敏感性；cRNA與RNA之間形成的雜交體比cDNA-RNA雜交體更穩定；且cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響，因此雜交反應后可用RNA酶處理，以除去未結合的探針，可降低本底信號的影響。

制備特異性強、靈敏度高和穩定性強的腫瘤檢測探針，生產易保存和運輸的相關試劑及試劑盒，對腫瘤早期診斷和治療至關重要。研發出用于診斷和治療多種腫瘤的高品質探針及相關試劑盒，不僅能提高人民的健康水平，而且具有很大的經濟效益、社會效益及廣闊的市場前景。

CA19-9(carbohydrate antigen 19-9)是一種粘蛋白質的糖類蛋白腫瘤標志物，為細胞膜上的糖脂質，因由鼠單克隆抗體119NS199-9識別而命名。CA19-9是一種分子量為5000KD的低聚糖類腫瘤相關抗原，由內胚層細胞分化而來的，正常人血清中含量甚微，而在多種上皮類惡性腫瘤血清中均可見增高。

在血清中CA19-9以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎兒胰腺、膽囊、肝、腸和正常成年人胰腺、膽管上皮等處。正常情況下CAl9-9的合成量極微，但當上述組織出現異常時，尤其是惡性腫瘤時，其合成量可以顯著增加，造成血清中的CAl9-9增加。CAl9-9是迄今報道的對胰腺癌敏感性最高的標志物，胰腺癌的CA19-9最高水平是正常均值的683倍，故其是胰腺癌較好的標志物。

發明內容

本發明的目的是提供一種以CA19-9cDNA為模板制備RNA探針的方法。