[發明專利]一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法

在審

• 申請號: 201610082224.0
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105660404A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 李波;賈秀峰;趙宇佳;徐婉玉;馬赫;陳雪梅
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/06
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明屬于生物技術育種領域，具體涉及一種抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法。

背景技術

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上廣泛分布且享有盛譽的優良牧草，被稱為 “牧草之王”，不僅能改良土壤，還可以增加優質蛋白質，是發展優質高效畜牧業的物質 基礎，也是人類有益健康與保健的食用植物之一。

我國苜蓿產業的發展嚴重受到種質資源的限制，缺乏適應不同地區苜蓿品種的種子， 為了滿足現代化畜牧業發展的需要，擴大苜蓿的種植面積，培育、繁殖適應不同生境條件 不同使用目的的苜蓿品種，已成為發展我國苜蓿產業的主要問題之一。

中國苜蓿育種通常采用選擇育種、雜交育種、雄性不育系育種、生物技術輔助育種、 航天育種等方法。各種方法均有應用，應用較多的是選擇育種和雜交育種。我國目前已選 育出的苜蓿新品種均采用了常規育種技術和方法(引種選擇、鑒定篩選、雜交育種)。國 內育成的品種都是采用傳統的常規育種技術和方法育成的，普遍采用的是引種馴化、人工 選擇、雜交育種、誘變育種、鑒定篩選等育種方法，而細胞誘變、細胞融合、雜種胚培養 等細胞工程現代生物技術在牧草育種中的應用幾乎還是空白。利用現代植物組織培養等生 物技術選育出的品種尚未見報道。目前，我國登記的品種當中沒有單純應用生物技術育成 的品種。較多的研究集中于抗性基因的轉化與基因表達，以提高苜蓿的抗性。選育適應干 旱、嚴寒、沙化、鹽堿化等不同生態條件的苜蓿品種對保護生態環境、充分利用國土資源、 滿足市場對草飼性畜產品的需求有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有常規育種方法得到的苜蓿抗旱性較差，移栽成活率不高 的問題，而提供對干旱具有抗性的苜蓿愈傷組織再分化成芽和根的方法。

本發明抗PEG苜蓿愈傷組織再分化的方法按下列步驟實現：

一、將經NaN₃誘變和PEG脅迫處理后的苜蓿愈傷組織(莖段為外植體)接種于MS固 體培養基中,在23～25℃下培養,每日光照射12h，1000Lx光照強度，培養18～22d(天) 完成1次繼代，重復繼代培養多次，得到繼代培養后的愈傷組織；

二、將步驟一得到的繼代培養后的愈傷組織分割成塊狀，然后接種到含有NAA和6-BA 的芽分化MS培養基上，在溫度為23～25℃，每日光照射16h，2000～4000Lx光照度的 條件下進行培養，得到分化出芽的苜蓿組織；

三、將分化出芽的苜蓿組織在分芽處切斷成兩段，分段后移接到以1/2MS或MS為基 本培養基的生根培養基上，在溫度為23～25℃，1000～2000Lx的光照度，每天光照16h 的條件下在培養瓶中進行培養，得到分化出根的無菌苗；

四、當分化出根的無菌苗長到2～3cm并有4～5條粗壯根系時，在培養室內將培養瓶 口打開，進行2～5d的煉苗，然后挑選株高為4～5cm，并有4～5條粗壯根系的幼苗移栽 到營養土中進行培養，完成抗PEG苜蓿愈傷組織的再分化；

其中步驟二所述的芽分化MS培養基為MS+2.0mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂；

當步驟三所述的生根培養基以1/2MS為基本培養基時，生根培養基為1/2MS+0.15 mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L瓊脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+10g/L瓊脂+0.5g/L活性炭；

當步驟三所述的生根培養基以MS為基本培養基時，生根培養基中含有0.05～0.10 mg/LNAA、1.0～1.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、0～2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L瓊脂、 0.5g/L的活性炭和15ml鐵鹽母液，其中所述的鐵鹽母液是將2～3gFeSO₄·7H₂O和3～ 4gNa₂-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶于1L去離子水中得到的。