[發明專利]蛋白AqpSS9作為水通道蛋白的應用及利用無細胞蛋白合成體系合成并純化活性蛋白AqpSS9的方法

在審

• 申請號: 201610082207.7
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105624183A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 徐志南;杭寶建;黃磊;蔡謹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;B01D71/74;B01D69/02
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

技術領域

本發明涉及一種新型水通道蛋白AqpSS9及其應用，更具體地說，涉及一種通 過在無細胞體系中添加去污劑表達可溶性水通道蛋白，并進一步通過純化獲得水 通道蛋白AqpSS9的方法，并確證AqpSS9具有水通道蛋白的透水功能，同時利用 AqpSS9構建了具有透水活性的仿生膜。

背景技術

隨著世界范圍內淡水及能源日益短缺，愈來愈多地關注海水及半咸水的淡 化。使用諸多技術，諸如多效蒸餾(multi-effectdistillation，MED)、多級閃 蒸(multistageflash，MSF)及蒸汽壓縮以及膜淡化(如逆滲透(reverse osmosis，RO)或納米過濾(nanofiltration，NF))。生物膜展示經由水通道蛋白 (AQP)蛋白質跨滲透壓梯度的水輸送特性的最有效方式，其中水通道蛋白結合于 磷脂細胞膜中，水可自由通過生物膜而離子卻不能。反滲透膜在應用的過程中需 要具有耐壓和耐鹽的特點，對基于水通道蛋白的反滲透膜進行改性對其推廣應用 有重要的意義。

AqpSS9來源于嗜壓菌P.profundumSS9，與大腸桿菌水通道蛋白AqpZ的同源 性高達67％，具有水通道蛋白的標志性功能位點標志性功能位點(NPA)、6個跨膜 區域以及5個環狀連接結構，并根據P.profundumSS9的嗜壓生理特點推測該蛋 白可能屬于具有一定抗逆性的水通道蛋白，即該蛋白可能在對抗高靜壓力、高鹽 度等惡劣條件方面將呈現出天然的優勢。開展AqpSS9的性能研究，確證AqpSS9 的水通道蛋白功能，既為開發高效、穩定的生物模擬膜提供了強大的功能蛋白基 礎，也為揭示深海生物嗜極現象提供了有力的實驗證據。但是缺乏有效手段獲得 足夠量的AqpSS9蛋白樣品已成為開展AqpSS9的研究及應用的主要瓶頸。主要由 于AqpSS9蛋白強烈的疏水性，它在細胞內的大量表達會造成細胞毒性，影響宿主 細胞的正常代謝，因此其表達水平受到大大的限制，很難滿足結構學研究和制備 基于水通道蛋白的水回收裝置的要求。

發明內容

本發明首先所要解決的技術問題是提供蛋白AqpSS9作為水通道蛋白的應 用，蛋白AqpSS9的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

進一步地，所述作為水通道蛋白的應用為用于制備仿生膜。

所獲得的水通道蛋白制備仿生膜具有透水性，當仿生膜的水通道蛋白 AqpSS9與磷脂的質量比為0時水通量為0.4L·m^-2·h^-1，當仿生膜的水通道蛋白 AqpSS9與磷脂的質量比提高到1/200時水通量上升到2.2L·m^-2·h^-1，當仿生膜的水 通道蛋白AqpSS9與磷脂的質量比提高到1/50時水通量上升到2.7L·m^-2·h^-1。所述 磷脂由75％的1,2-二油酰基磷脂酰膽堿和25％的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺構 成。

編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

蛋白AqpSS9具有透水的功能，空脂質體的水通透因子P_f值為89.3±1.8μm/s， 嵌有AqpSS9的脂蛋白體的P_f值為310.7±3.2μm/s，AqpSS9的單體水通透因子 P_f,mono為1.24×10^-20m³/s。

本發明還提供了含上述核苷酸序列的一種表達載體pIVEX-2.4c-AqpSS9，所 述表達質粒pIVEX-2.4c-AqpSS9是利用PCR擴增出AqpSS9基因并克隆到 pIVEX-2.4c質粒上構建的。

本發明還提供了一種利用無細胞蛋白合成體系合成并純化活性蛋白AqpSS9 的方法，其特征在于，其無細胞蛋白合成體系具有如下特征，在無細胞蛋白的合 成體系中添加去污劑Brij-78至0.7％，并加入所述表達載體pIVEX-2.4c-AqpSS9至 10μg/ml，37℃，400rpm反應4h后可溶性的AqpSS9的產量達到565mg/L。

附圖說明

圖1為AqpSS9表達載體pIVEX-2.4c-AqpSS9的結構示意圖。