[發明專利]用于稻田廣食性捕食天敵獵物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用

有效

• 申請號: 201610081432.9
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105567843B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 王光華;高其康;王雪芹;祝增榮;程家安
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種用于稻田中廣食性捕食天敵獵物譜的高通量測序復合標簽及其應用，復合標簽的序列如編號NO.1～NO.48所示。標簽的應用方法包括：提取每一個樣本的總DNA；對每一個樣本，從48對且未被選擇過的序列中選擇任意一對序列作為引物，對對應樣本的總DNA進行擴增；對每一個樣本的擴增產物進行電泳檢測，對擴增產物進行純化回收；對每個樣本純化回收后的產物進行精確定量；將所有樣本等量混合后建立一個基因文庫；對所建基因文庫進行高通量測序。本發明提高超高通量測序的樣本通量，有效降低超高通量測序成本，有效富集樣本中整個稻田生態系統中節肢動物種群，為探明稻田中捕食性天敵獵物多樣性研究提供高通量分析途徑。

技術領域

本發明涉及基因測序技術領域，具體涉及一種用于稻田生態系統廣食性捕食天敵獵物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用。

背景技術

稻田廣食性捕食天敵與稻田有害生物防治技術研發密切相關，由于節肢動物形態分類的困難和捕食性天敵獵物檢測識別技術的限制，阻礙了稻田生態系統捕食性天敵獵物譜及獵物轉換機制和生防技術的深入研究，宏條形碼技術的出現使此問題的解決變為可能。因此，利用節肢動物獨特的線粒體基因組細胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)為靶標序列(Hebert等，2003.Hebert P,et a1.,2003.Biological identifications through DNAbarcodes.Proceedings of the Royal Society,270(1512):313-321)，用PCR擴增的方法從復雜樣本中富集節肢動物或捕食性天敵體內殘留的獵物DNA，利用所擴增序列代表種的特異性來檢測捕食性天敵的獵物譜，是一種非常有效的方法。

本發明所指的節肢動物線粒體基因組細胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)微型條形碼區域是指稻田生境中全部節肢動物COI微條形碼序列的總和，為研究節肢動物多樣性、種群結構、進化關系、相互協作關系及與環境之間的關系提供了一條新的思路。

在動物分類領域，DNA barcoding采用的標記基因主要是線粒體COⅠ基因；該基因在引物對應部分比較保守，其它序列部分變異相當大，并且容易利用通用引物進行PCR擴增；同時在近緣種間，這段基因的差異也足夠大，因此適合作為動物分子鑒定的標記，也是目前在動物分子生態學上應用最廣泛的分子標記。線粒體DNA(mtDNA)結構簡單、幾乎不發生重組、進化速度快且不同區域進化速度存在差異等特點，被公認為是研究動物系統發育的重要標記。線粒體基因組包括13個蛋白質編碼基因，2個rDNA基因，22個tRNA編碼基因和一個非編碼區。最常見于物種鑒定研究的mtDNA基因是細胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)和16SrRNA基因。由于COI基因具有相對高的種間變異和低度的種內變化，以及相當長的變化序列，又容易擴增，使得COI成為能夠鑒別密切相關的物種的重要DNA條形碼之一。

發明內容

本發明提供一種用于廣食性捕食天敵獵物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用，提高超高通量測序的樣本通量，有效降低超高通量測序成本，有效富集樣本中所含稻田節肢動物種群，為探明稻田捕食性天敵獵物譜及其獵物轉換機制研究提供高通量分析途徑。

該種用于稻田生態系統廣食性捕食天敵獵物多樣性高通量測序的復合標簽及其堿基序列如下序列編號NO.1～NO.48所示。

本發明復合標簽的每一條序列均由左側8～12個堿基組成具唯一性序列和右側23～27個源于細胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)的序列所組成。其中，右側23～27個源于COI的序列具有一定的簡并性，序列中的R為A或G；S為C或G；W為A或T；Y為C或T。

表1 復合標簽序列。

本發明還提供一種利用所述復合標簽進行超高通量基因測序的方法，包括如下步驟：

(1)提取每一個樣本的總DNA；