[發明專利]艱難梭菌毒素A/B的熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201610080808.4
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105525023A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 羅寶花;曾宏彬;陳杰
• 申請（專利權）人: 廣州賽哲生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;宋靜娜

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，尤其涉及一種艱難梭菌毒素A/B的探針法熒光 定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

艱難梭菌(ClostridiumDifficile，C.difficile)是一種革蘭陽性、產毒素或 非產毒素的厭氧芽胞桿菌，它廣泛分布于自然環境、動物和人的糞便中。艱難 梭菌可以寄生在在人類的腸道中，它本身并沒有侵襲性，但研究發現，長期使 用廣譜抗生素，尤其是克林霉素、頭孢菌素類、喹諾酮類抗生素后，引起菌群 失調，使耐藥的艱難梭菌被選擇出后大量繁殖，出現艱難梭菌相關性感染，導 致C.difficile相關性腹瀉，目前已被公認為引起抗菌藥物相關性腹瀉(antibiotic associateddiarrhea,AAD)和假膜性腸炎(Pseudo-membranecolitis，PMC)的重要 致病菌。艱難梭菌感染(CDI)患者臨床表現輕者自限性腹瀉，重者可出現偽膜 性腸炎及中毒性巨結腸。CDI具有復發率高、耐藥率高、難治率高、死亡率高、 醫療費用高等特點。因此，艱難梭菌的快速鑒定及其毒素檢測工作迫在眉睫。

近年來，艱難梭菌的診斷方法有依賴于厭氧條件的細菌培養、依賴于抗體 制備的谷氨酸脫氫酶(GDH)ELISA檢測法、依賴于基因組DNA提取的分子診 斷技術。依賴于菌株培養的毒素測定法鑒定時可獲得相應菌株，方便后續研究， 但艱難梭菌屬于厭氧菌，培養困難，費時費力。谷氨酸脫氫酶(GDH)ELISA 檢測法需要制備抗體，成本高，過程繁瑣耗時長，且其穩定性雖好但特異性差， 無法區分C.difficile產毒株與無毒株。目前，檢測C.difficile應用最多的是處于 研究前沿的分子生物學檢測法，該方法可以不經培養直接從樣品中提取腸道微 生物基因組，利用分子生物學手段進行分離、檢測和定量，其結果可以比較準 確的反應腸道微生物中高豐度菌種的組成及其含量。

隨著核酸技術發展，16SrDNA序列分析已成為鑒定細菌的金標準。利用16S rDNA序列保守區域設計引物，此引物幾乎能與所有種屬的核糖靶位點結合。能 夠進行快速鑒定，從而及時給予抗菌治療。然而，該方法也有局限性，當不同 種細菌16SrDNA序列幾乎完全相同時，其鑒定能力就受到限制(如葡萄球菌和 伯克霍爾德菌的鑒定)。

C.difficile產生的毒素A(tcdA基因編碼的產物)又稱腸毒素，導致回腸腸 壁中性粒細胞浸潤，釋放淋巴因子，引起液體大量分泌和出血性壞死；毒素B (tcdB基因編碼的產物)又稱細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，導 致細胞固縮壞死，直接損傷腸壁細胞。C.difficile的各菌株根據它們的毒素產生 性的不同，大致分為TcdA產生TcdB產生型(A+B+)、TcdA非產生TcdB產生 型(A-B+)以及毒素非產生型(A-B-)。有研究表明，A-B+菌株在中國具有發 病比例高，隱蔽性強，耐藥性高的特點，對臨床科室的危害性更為嚴重。因此， 選擇tcdA和tcdB作為檢測艱難梭菌的目的基因，對艱難梭菌毒性菌株實施簡 單、靈敏且快速檢測，對于臨床診治具有重要意義。

用實時熒光定量PCR的方法來檢測外源基因的拷貝數，是近幾年迅速發展 起來的新方法，它以低成本、快捷、高靈敏度等優點，逐漸取代了價格昂貴、 費時費力的Southernblot法。根據熒光信號的來源不同對熒光定量的方法進行劃 分，主要包括特異性熒光探針(如TaqMan探針)法和非特異性熒光染料(如 SYBRGreen染料)法。由于SYBRGreen染料能與所有的dsDNA相結合，因 此由引物二聚體、錯誤的擴增產物引起的假陽性，會增大定量數據的誤差。 目前針對艱難梭菌的定量檢測，已報道比較多的方法是多重實時熒光定量PCR (多重qPCR)。雖然該方法可以一次性檢測多個靶標基因，但也存在很多弊端， 例如1)引物設計難度大：復雜的多重qPCR引物設計必須依賴于較為大型的數據 庫和計算機模擬qPCR結果，以及繁瑣的后期驗證，這個過程不是一般小型實驗 室可以完成的；2)產物相互抑制：多重qPCR副產物焦磷酸的生成，會抑制qPCR 反應的延伸；3)在一個qPCR反應體系里，dNTP原料的量是一定的，所以，每 增加一重引物，就會使dNTP原料平分到每個靶標的量減少。

發明內容