[發明專利]一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法

有效

• 申請號: 201610080377.1
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105624304B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 焦爽;范兆飛;尤鋒;徐冬冬;譚訓剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎;周秀梅

本發明涉及幼魚性腺mRNA原位雜交技術，具體的說是一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法。取洗滌后樣品經過量濃度為4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于?20℃保存，將上述固定后保存樣品經處理作為原位雜交樣品；上述原位雜交樣品進行復水、洗滌、蛋白酶K消化、固定而后經洗滌、預雜交，預雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50?70℃下雜交過夜；雜交處理后洗滌，并經抗體孵育，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，再洗滌，20?30％蔗糖沉降；上述沉降樣品經OCT包埋后進行冰凍切片，進而實現對牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的標記。本發明的實施能夠清晰地描述牙鲆相關基因在性腺中的定位(mRNA水平)，取得了突破性的進展。

技術領域

本發明涉及幼魚性腺mRNA原位雜交技術，具體的說是一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法。

背景技術

牙鲆，俗稱牙片，為鲆鰈魚類，錄屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國和日韓等國的重要海水養殖魚類。牙鲆具有雄魚比雌魚生長快、個體大的特點，牙鲆已逐步在性別決定與分化研究領域成為海水經濟魚類模式物種，研究其性別決定與分化的機制，確定性別決定與分化相關的基因，并以此為基礎，對其實施性別控制，具有重要的理論和實踐意義。通過牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交可以解析性別決定和分化相關基因的表達模式及相互關系，但是牙鲆幼魚早期性腺較小、分離困難，而性腺組織較大時期難以直接進行性腺原位雜交，使得該技術難以應用。因此建立牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，對于牙鲆性別決定和分化相關規律的闡述具有重要的意義；另外本發明在其它魚類幼魚性腺等組織的原位雜交進行基因定位和功能研究方面將有一定應用前景，甚至可以開發相關檢測試劑盒而進行產業化生產。

發明內容

本發明在于提供一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法。

為實現上述目的本發明采用的技術方案為：

一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法：

1)取洗滌后樣品經過量濃度為4％PFA溶液固定；固定后用100％甲醇溶液于-20℃保存，將上述固定后保存樣品經處理作為原位雜交樣品；

2)上述原位雜交樣品進行復水、洗滌、蛋白酶K消化、固定而后經洗滌、預雜交，預雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70℃下雜交過夜；雜交處理后洗滌，并經抗體孵育，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，再洗滌，20-30％蔗糖沉降；

3)上述沉降樣品經OCT包埋后進行冰凍切片，進而實現對牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的標記。

所述樣品為根據幼魚全長不同分別取樣，幼魚全長<60.0mm的取其整個腹部；幼魚全長>60.0mm直接剝離性腺，取樣后無RNA酶的PBS緩沖液漂洗，待用。

所述經固定后保存的腹部樣品去除多余內臟；經固定后保存的性腺樣品的系膜剝離去除、將性腺切成約5mm。

具體待做原位雜交前，將上述固定后保存樣品進行進一步處理(腹部樣品盡量去除多余內臟，性腺樣品的系膜剝離去除、將性腺切成5mm左右大小)，以獲得原位雜交樣品；

將原位雜交樣品依次經體積比3：2和2：3的，濃度為100％甲醇和無RNA酶的1×PBST緩沖液分別進行復水處理10-30min，復水處理后用過量的無RNA酶的1×PBST緩沖液洗滌，洗滌后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37℃處理消化10-30min，消化后經過量的4％PFA溶液再固定20-60min，再固定后經過量無RNA酶的1×PBST緩沖液洗滌，洗滌后樣品在過量預雜交液中于50-70℃預雜交2-5h。

所述無RNA酶的1×PBST緩沖液成分為：136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mMNa2HPO4，1.76mM KH2PO4，0.1(v)％Tween-20，由無RNA酶水配置，PH7.4。