[發明專利]一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法

有效

• 申請號: 201610080377.1
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105624304B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 焦爽;范兆飛;尤鋒;徐冬冬;譚訓剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 李穎;周秀梅

1.一種牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：

1）取洗滌后樣品經過量濃度為4% PFA溶液固定；固定后用100%甲醇溶液于-20℃保存，將上述固定后保存樣品經處理作為原位雜交樣品；

2）上述原位雜交樣品進行復水、洗滌、蛋白酶K消化、固定而后經洗滌、預雜交，預雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70℃下雜交過夜；雜交處理后洗滌，并經抗體孵育，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，再洗滌， 20-30%蔗糖沉降；

3）上述沉降樣品經OCT包埋后進行冰凍切片，進而實現對牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的標記；

步驟1）中樣品為根據幼魚全長不同分別取樣，幼魚全長<60.0 mm的取其整個腹部；幼魚全長>60.0 mm直接剝離性腺，取樣后無RNA酶的PBS緩沖液漂洗，待用；

步驟1）中固定后保存樣品經處理為腹部樣品去除多余內臟；

或，性腺樣品的系膜剝離去除、將性腺樣品切成約5mm。

2.按權利要求1所述的牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：將原位雜交樣品依次經體積比3：2和2：3的，濃度為100%甲醇和無RNA酶的1×PBST緩沖液分別進行復水處理10-30min，復水處理后用過量的無RNA酶的1×PBST緩沖液洗滌，洗滌后加入10μg/ml的蛋白酶K于37℃處理消化10-30 min，消化后經過量的4% PFA溶液再固定20-60min，再固定后經過量無RNA酶的1×PBST緩沖液洗滌，洗滌后樣品在過量預雜交液中于50-70℃預雜交2-5h。

3.按權利要求2所述的牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：所述預雜交液為50(v)%去離子甲酰胺，25(v)% 20×SSC，50μg/ml肝素，500μg/ml 酵母tRNA，0.1(v)%Tween-20，1M 的檸檬酸460μl，加無RNA酶的水定容至50ml。

4.按權利要求1所述的牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：所述含有牙鲆RNA探針的雜交液是將用預雜交液稀釋RNA探針至終濃度為1-2ng/μl，再將其置于80℃變性30min，變性后，待用。

5.按權利要求1、3或4所述的牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：所述預雜交后與含有牙鲆RNA探針的雜交液混合于50-70℃下雜交過夜，然后依次于50-70℃下用過量的體積比為1:1的不含肝素和酵母tRNA的預雜交液和2×SSC的混合液洗滌30-60min，洗滌后用過量2×SSC洗滌30-60min，再用含0.1% CHAPS 的0.2×SSC洗滌兩次，每次30-60min；最后在室溫下用MAB溶液洗滌5-10 min。

6.按權利要求1所述的牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：所述雜交處理洗滌后樣品用封閉液于室溫下水平搖床封閉2-4h，而后加入堿性磷酸酶抗體在4℃孵育過夜，再洗滌，避光顯色，終止顯色，再固定，再洗滌，20-30%蔗糖沉降。

7.按權利要求6所述的牙鲆幼魚性腺mRNA原位雜交的方法，其特征在于：所述封閉液為含10%羊血清、2%封閉劑的1×MAB。