[發明專利]一種霍亂弧菌多重熒光PCR檢測試劑盒及其制備與應用

有效

• 申請號: 201610080203.5
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105603091B
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 柯昌文;李柏生;柯碧霞;肖紅;邵俊斌;朱勤瑋;王凱;熊磊;李鴻雁
• 申請（專利權）人: 廣東省疾病預防控制中心;杭州博康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 郭婧婧;許亦琳

本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種霍亂弧菌多重熒光PCR檢測試劑盒及其制備與應用。本發明所述試劑盒中含有包括霍亂弧菌溶血素基因檢測引物及探針、霍亂弧菌O1群抗原基因檢測引物及探針、霍亂弧菌O139群抗原基因檢測引物及探針、霍亂弧菌腸毒素基因檢測引物及探針，所述試劑盒檢測靈敏度高，最低檢出限為1×10³copy/ml，準確率及陽性率均高達100%。

技術領域

本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種霍亂弧菌多重熒光PCR檢測試劑盒及其制備與應用。

背景技術

霍亂是一種烈性腸道傳染病，是我國的法定報告傳染病之一，病原體為霍亂弧菌(Vibrio cholerae)。霍亂發病急驟，傳播迅速，患者有劇烈的腹瀉和嘔吐癥狀，會導致脫水、休克等一系列嚴重的綜合征，未及時確診和治療者死亡率較高。

目前，根據菌體抗原的不同，霍亂弧菌可分為210多個血清群，其中僅O1群和O139群會導致霍亂流行。O1群又分為古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型(El Torbiotype)。霍亂曾發生7次世界性大流行，前6次均由O1群古典生物型引起，而自1961年起發生的第7次世界性大流行則由O1群埃爾托生物型引起，波及140多個國家和地區，至今未見平息，近年來疫情還有所增加。O139群主要流行于亞洲。其他血清群的霍亂弧菌僅導致偶然的散發病例或聚餐引起的很小規模的爆發，統稱為非O1/非O139群。霍亂弧菌的致病因素之一為霍亂毒素(cholera toxin，CT)，產生毒素的霍亂弧菌致病力強，能引起霍亂暴發和流行。而不產毒的O1群和O139群則不會引起大流行。因此，準確快速地鑒定霍亂弧菌的血清群類型和產毒能力對評價霍亂疫情風險，及時制定有效的防控策略有重要意義。

霍亂弧菌的傳統檢測方法有：細菌分離培養法、糞便涂片鏡檢法、生化特征檢測法、血清學凝集分型法、噬菌體分型法等。雖然細菌培養、生化和血清學鑒定方法一度是實驗室診斷霍亂弧菌的“金標準”，但傳統的檢測方法均存在周期長，工作量大，易受培養條件及操作人員經驗等主客觀因素影響等不足，不能滿足疾病預防和控制快速反應體系的需要。近年來，分子生物學技術因其操作簡單、靈敏度高、反饋快速、結果準確等優點，越來越廣泛地應用于霍亂弧菌的檢測和分型研究中。

在分子生物學檢測方法中，普通的PCR法檢測霍亂弧菌的靈敏度和特異性雖然很高，但每次只能檢測一個基因，效率較低；用凝膠電泳對擴增產物進行分析時，容易造成交叉污染；電泳結果往往需要實驗人員主觀進行判斷，準確度欠佳。相較而言，多重熒光PCR方法可在一次反應中檢測多個基因，節約了時間和成本；用儀器來識別熒光信號，提高了檢測靈敏度，降低了檢測限，減少了人工誤差；在擴增反應過程中對熒光信號進行實時檢測，全程封閉進行，大大降低了樣本間交叉污染的風險。

鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)是新型的核酸類似物，它包含了2'-氧4'碳亞甲基連接，這個連接限制了呋喃核糖環的靈活性，將其結構鎖定成一個剛性的雙環模式。由于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架，故其對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力，能夠提高引物/探針的雜交效率和穩定性；同時還可以提高目標序列雜交的特異性。使得由非所需激活的熒光背景大量減少，從而增大信號對背景噪音的比例，提高分辨度。與普通的Taqman探針相比，其雙鏈在相同的鹽溶液中，每增加一個單體LNA分子將導致其熔點提高8℃，這樣強化后的雜交性能可以顯著擴大實驗檢測的環境限制，即通過調整LNA堿基在探針序列中的位置來調節Tm值和雜交特異性。此外，由于LNA強化的雜交特征和對熔點溫度的影響，含有LNA的實時定量PCR探針，長度較短，可以增加設計的靈活性，從而減少或消除普通DNA探針某些設計的局限或無法解決的問題。

發明內容

針對傳統檢測手段中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種霍亂弧菌多重熒光PCR檢測試劑盒及其制備與應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：