[發明專利]諾如病毒的逆轉錄環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201610079851.9
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105648111B
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 羅鴻斌
• 申請（專利權）人: 東莞理工學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 譚一兵

本發明公開了一種諾如病毒的逆轉錄環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒。檢測引物組包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內引物FIP、下游內引物BI P，分別如SEQ ID NO.1、2、3和4所示。本發明建立的檢測NV的RT?LAMP技術簡便、特異、靈敏，適用于野外和簡易實驗室檢測，提供了新的病毒檢測方法。在樣品檢測中，RT?LAMP技術的靈敏度達97.7％，高于RT?PCR的90.7％，更適用于野外樣品和簡陋實驗室的快捷檢測，可廣泛應用于醫院、食品行業、出入境檢驗檢疫及質量監督等部門及領域。

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種諾如病毒的逆轉錄環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒。

背景技術：

諾如病毒感染性腹瀉具有發病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點，是引起非細菌性腹瀉暴發的主要病因。諾如病毒感染性強，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，常在社區、學校、餐館、醫院、托兒所、孤老院及軍隊等處引起集體暴發。不同地區、不同時間流行的諾如病毒，其基因RNA多聚酶區序列相對保守。根據RNA多聚酶區核苷酸序列的相似性，諾如病毒被分為5個基因群(genogroup)。同一基因群內的諾如病毒，其主要衣殼蛋白(major capsid protein)氨基酸序列的異質性約為30％，但不同基因群間的諾如病毒，其主要衣殼蛋白(major capsid protein)氨基酸序列的異質性超過50％。目前已知，感染人類的諾如病毒至少包括基因Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅳ群。諾如病毒對各種理化因素有較強的抗性，已知其耐熱和耐凍，60℃孵育30min仍有感染性，冷凍數年后仍保持活性；對乙醚和酸穩定，20％乙醚4℃處理可存活18h，室溫pH2.7環境下可存活3h。諾如病毒對處理污水的10ppm的氯濃度敏感，但對處理飲用水的3.75～6.25ppm的氯濃度耐受。此外，諾如病毒的感染劑量很低，10-100個病毒粒子即可使人致病，而且諾如病毒常呈暴發流行，因此，即使環境中存在的微量病毒，仍然對人得健康存在很大威脅。

諾如病毒遺傳高度變異，在同一時期和同一社區內可能存在遺傳特性不同的毒株流行。諾如病毒抗體沒有顯著的保護作用，尤其是沒有長期免疫保護作用，極易造成反復感染。諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內均有流行，全年均可發生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節呈現高發。美國每年在所有的非細菌性腹瀉暴發中，60-90％是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發達國家也都有類似結果。在發展中國家，諾如病毒感染性腹瀉普遍存在，也常引起暴發流行。在我國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15％左右，血清抗體水平調查表明我國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。

目前諾如病毒病原的檢測方法有電鏡技術、病毒分離培養技術、免疫學技術及分子生物學技術，但上述的前三種技術往往存在靈敏度較低、操作繁瑣耗時、需要大型昂貴的儀器設備等缺點，在應用時往往有其局限性，尤其不能適用于大規模的病原篩查和檢測等實際應用。分子生物學技術，其中尤其以RT-PCR檢測技術由于其快速、靈敏、適合處理大通量的樣品等特點，在病毒檢測中顯示出其優越性并越來越多的得以應用，但該方法從檢測到結果的判讀仍然需要多種專用儀器，操作較為繁瑣，所需時間仍然在5小時以上，常有非特異性出現等缺陷。LAMP方法是2000年Notomi等開發的一種新型核酸擴增技術，針對待測靶基因的6個區域設計4-6條特異性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等溫條件1h內可以進行特異高效快速的核酸擴增，達到10⁹拷貝，擴增結果可直接觀察焦磷酸鎂沉淀或者加入顯色劑進行判斷。近年來LAMP方法已廣泛用于細菌、病毒等致病微生物的檢測，并在此基礎上發展了RT-LAMP檢測方法，成功應用于多種RNA病毒的檢測。

發明內容：

本發明的第一目的是提供一種應用逆轉錄環介導等溫擴增檢測諾如病毒(norovirus)的檢測引物組，利用該檢測引物組可以特異性的檢測諾如病毒(norovirus)。

一種應用逆轉錄環介導等溫擴增檢測諾如病毒的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成：