[發明專利]一種干細胞分化培養基及其應用

有效

• 申請號: 201610079144.X
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105624114B
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: 陳運賢
• 申請（專利權）人: 廣東盈生力健康科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 蘇運貞

技術領域

本發明涉及生物領域，特別涉及一種干細胞分化培養基及其應用。

背景技術

當前分析造血干/祖細胞分化潛能的培養基是半固體培養基(MethoCult^TM)，原理是造血干/祖細胞在含有增殖分化添加因子的半固體介質下增殖分化形成集落，基于這種半固體培養基的評估方法就是經典的集落形成單位實驗(ColonyForming Unit Assay)。基于半固體培養基的集落形成實驗分析方法只能分析一群混合細胞，優勢僅僅局限于分析一個細胞群中能夠形成各種造血集落的種類和數量，但是不能在單細胞水平上精確分析單個造血干/祖細胞的分化潛能。雖然半固體培養基可以局限單個細胞在形成集落時候的遷移，現實操作中無法排除一個混合型集落是單個細胞分化產生還是多個細胞因空間位置疊加在一起分化導致的混合細胞污染。此外，集落形成實驗使用培養基的最小單位是3.3ml，可以分析兩個細胞混合物重復樣品，并且每個單位使用浪費大約1.1ml半固體培養基，浪費率達33％。基于半固體培養基的集落形成實驗，還存在如下不足：半固體培養基粘稠的因素導致操作費時，不利于大規模批量化操作；在用移液器或者注射器吸取半固體培養基的時候難以精確控制培養基體積，從而在重復樣品之間引入較大誤差。

發明內容

本發明的目的在于克服現有造血干祖細胞分化潛能體外評估技術的缺點與不足，提供一種干細胞分化培養基。

本發明的另一目的在于提供所述干細胞分化培養基的應用。在造血干/祖細胞分化潛能體外評估技術應用上述干細胞分化培養基，能實現10～14天快速、大批量評估單個造血干祖細胞的分化潛能，精確率100％，不會出現判斷誤差。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種干細胞分化培養基，成分組成如下：以α-MEM為基礎培養基，按比例添加如下成分：終濃度為體積百分比10～20％的FBS(胎牛血清)、終濃度為質量體積比0.1～1％的BSA(牛血清蛋白)、終濃度為10^-4～10^-5mol/L的2-β-mercaptoethanol(巰基乙醇)、終濃度為1～5mM的L-gln(左旋-谷氨酰胺)、終濃度為10-100ng/ml的SCF(干細胞因子)、終濃度為10-50ng/ml的IL3(白介素3)、終濃度為1～5U的EPO(促紅細胞生成素)、終濃度為10～100μg/ml的維生素C、終濃度為1～20μg/ml的(±)-α-Lipoic acid(硫辛酸)。

所述的干細胞為造血干/祖細胞。

所述的干細胞分化培養基在對造血干/祖細胞分化潛能評估中的應用，特別適合應用于對單個造血干/祖細胞分化潛能進行評估。

所述的干細胞分化培養基在對造血干/祖細胞分化潛能評估中的應用，包括如下步驟：

(1)將所述的干細胞分化培養基加入到細胞培養板中；

(2)通過流式分選儀，采用單細胞模式分選待分析細胞，往細胞培養板中的每個孔分選入一個待分析細胞；

(3)將含有單個細胞的細胞培養板轉入細胞培養箱，37℃、5％CO₂條件下培養10～14天；在培養期間，隔天更換新鮮的干細胞分化培養基，更新方法為移出一半舊的培養基，添加等體積新鮮的37℃預熱培養基；

(4)對步驟(3)培養增殖得到的細胞進行檢測，確定待分析細胞的分化潛能。

步驟(1)～(3)為在無菌條件下進行操作。

所述的細胞培養板優選為96孔細胞培養板。

步驟(4)中所述的檢測的方法包括細胞甩片、細胞染色形態學分析以及流式免疫表型分析。

所述的細胞染色形態學分析為吉姆薩染色分析。

所述的流式免疫表型分析中所用到的抗體包括識別髓系巨噬細胞的抗體、識別髓系粒細胞的抗體、識別髓系紅系細胞的抗體。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

1、本發明提供的培養基能在單細胞水平上100％精確評估造血干祖細胞的分化潛能，避免了半固體培養基集落形成實驗中一個混合集落是因為污染多個造血干祖細胞的假陽性現象。

2、本發明提供干細胞分化培養基為液態培養基，克服了傳統的半固體培養基需要提前液化、因粘稠導致體積衡量不準確、吸取困難及重復樣品之間因體積不準確而誤差較大等缺點。

3、本發明提供的干細胞分化培養基可以在任意誘導分化時刻進行換液，便于及時更新新鮮培養基，維持細胞增殖分化的最佳條件。