[發明專利]一種古代羊毛織品間接競爭法檢測試紙的制備方法

在審

• 申請號: 201610078943.5
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105717291A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 游秋實;王秉;劉意;劉楊
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及文物檢測技術領域，尤其涉及一種古代羊毛織品間接競爭法檢測試紙的制備方法。

背景技術

羊毛是一種天然動物毛纖維。具有角質組織，呈現光澤，堅韌并有彈性。因其產量高、種類多，可生產多種毛織品，是主要的毛紡工業原料。中國歷史悠久，從中國早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品文物，出土的大量羊毛制品文物對研究古代社會環境和人文活動具有重要參考價值。

羊毛的主要成分是角蛋白，在酸、堿、鹽、氧化劑、還原劑、鹵素等中羊毛都具有一定的不穩定性。此外羊毛還容易受到多種環境因素，如光照、射線和微生物等的影響，造成角蛋白發生變性和分子鏈的斷裂，從而使其降解破壞，傳統的檢測方法對文物樣品要求較高，而出土的羊毛制品文物一般都有不同程度的破損，對于破損文物尤其是腐朽文物的檢測存在一定難度。常用的酶聯免疫的方法，實驗時間較長，需要在實驗室進行，且檢測結果不夠直觀，不適合于考古現場分析，而取而代之的間接競爭法檢測用的膠體金試紙在定量分析上有缺陷，相對靈敏度低，也亟需完善。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種古代羊毛織品間接競爭法檢測試紙的制備方法。本發明方法操作簡單，制備的古代羊毛織品間接競爭法檢測試紙成本低，用于檢測時定量分析準確性高，反應時間短，靈敏度高，更加直觀，適合于考古現場的檢測。

本發明的具體技術方案為：一種古代羊毛織品間接競爭法檢測試紙的制備方法，其特征在于步驟如下：

A)熒光標記兔抗角蛋白抗體的制備：向每2.5-3.5mL的PBS緩沖液中依次加入0.14-0.16mg的熒光微球、2.6-2.8μL的現配的濃度為4-6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液和8-12μL的濃度為0.4-0.6mg/mL的兔抗角蛋白抗體溶液，得到A混合液，將所述A混合液在室溫下攪拌1.5-2.5h，用0.5-1.5wt%的牛血清蛋白溶液封閉25-35min后在8000-10000r/min、4℃條件下離心處理8-12min，移除上清液，將沉淀加入到體積為兔抗角蛋白抗體溶液30倍的PBS緩沖液中復溶、混勻，制得熒光標記兔抗角蛋白抗體溶液，將所述熒光標記兔抗角蛋白抗體溶液保存備用。

B)試紙條的組裝：用噴膜機將5-20體積份的羊毛角蛋白稀釋液和5-20體積份的山羊抗兔抗體稀釋液分別噴在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上，在36-38℃下烘干備用；將5-20體積份的熒光標記兔抗角蛋白抗體溶液稀釋10-20倍后包被在熒光結合墊上，在36-38℃下烘干備用；將樣品墊、熒光結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次組裝在PVC底板上，并切割成條狀，制得檢測試紙，將所述檢測試紙放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封儲存。

本發明利用免疫熒光層析技術的原理來檢測古代墓葬中羊毛織品的痕跡，即將兔抗羊毛角蛋白抗體進行熒光標記，然后將熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體溶解在熒光結合墊上，將羊毛角蛋白標準品和山羊抗兔IgG(H+L)抗體分別噴在硝酸纖維素薄膜上形成檢測線和質控線。樣品加入樣品吸收墊，樣品中的液體首先溶解結合墊中含有的熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體，同時，樣品中待測抗原與熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體結合，形成抗原-兔抗羊毛角蛋白抗體熒光復合物，并靠毛細作用向檢測線移動。樣品經過檢測線時，樣品中的抗原與硝酸纖維素膜上的抗原進行競爭兔抗羊毛角蛋白抗體。若樣品中含有抗原，聚集在硝酸纖維素膜上的熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體就會減少，檢測線不顯熒光。抗原–熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體或者熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體（樣品中不含有抗原）經過質控線，與山羊抗兔IgG(H+L)抗體反應，熒光標記的兔抗羊毛角蛋白抗體聚集在質控線上，在紫外照射下顯出明顯的熒光，且熒光強度可通過熒光定量儀測定。即若T/C（陽性）<T/C（陰性）證明樣品中含有羊毛角蛋白；若T/C（陽性）>T/C（陰性），證明樣品中未含有羊毛角蛋白或者羊毛角蛋白的濃度低于試紙條的檢出限。

作為優選，步驟A）中所述熒光微球為聚苯乙烯熒光微球，粒徑為100-110nm，激發波長為365nm，發射波長為610nm。

作為優選，所述PBS緩沖液的濃度為0.02mol/L，pH為5.5。

作為優選，步驟A）中所述牛血清蛋白溶液的用量為A混合液體積的1-1.2倍。

作為優選，步驟B)中所述硝酸纖維素膜的規格為長2.5cm，寬4mm。

作為優選，所述檢測試紙的寬度為4mm。