[發明專利]一種敲除豬DJ-1基因的細胞的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201610078125.5
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN107034192A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 趙建國;姚婧;黃嬌嬌;秦國嵩
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司11280
• 代理人: 李渤,郭廣迅

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及通過基因敲除培育實驗動物品種構建領域，具體涉及一種敲除豬DJ-1基因的細胞的構建方法以及基于該細胞獲得DJ-1基因敲除豬的構建方法。

背景技術

帕金森病是一種常見的神經退行性疾病，多見于老年人，平均發病年齡為60歲左右，以運動遲緩、靜止性震顫和肌強直為主要臨床特征，病變晚期出現不同程度的非運動功能障礙，如癡呆、抑郁、自主功能缺陷等，嚴重影響老年人的健康和生活質量。帕金森病的發病機理還不是十分清楚，很多研究顯示帕金森病是遺傳因素與環境因素等多因素導致的。其中，DJ-1基因的突變可引起早發型常染色體隱性遺傳帕金森病。

豬作為重要的農業動物，為人類提供了最主要的肉食來源；作為大型的實驗動物，與人類在許多方面都極其相似，如器官大小、解剖結構、生理學特性、代謝特性、神經學等，是人類疾病的理想模型動物和異種器官移植的適宜供體。

基因敲除技術是構建人類疾病模型的一種重要手段，是20世紀80年代發展起來的一種通過一定途徑使特定基因失活或缺失的分子生物學技術。傳統的基因敲除是建立在基因同源重組技術和胚胎干細胞技術基礎上的，主要是通過同源重組方法將外源基因定點整合入靶基因組的特異位點，從而達到對基因進行定點修飾的目的。此過程一般需要首先構建重組載體(打靶載體)，即把目的基因和與靶基因同源的片段重組到帶有標記基因(如neo基因等)的載體。將打靶載體通過一定方式導入胚胎干細胞或其他細胞后，一般需要利用標記基因來篩選陽性的細胞(如用G418篩選能表達neo基因的細胞)。通過顯微操作技術可以將陽性細胞轉變成為特定基因敲除的動物。

隨著基因敲除技術的發展，除了同源重組介導的基因敲除技術外，新的技術和手段逐漸被發現和應用，如ZFNs/TALENs。它們由具有特異性識別DNA序列的鋅指蛋白/TALE蛋白和非特異性的FokI核酸酶組成，可特異性地切割DNA片段，造成DNA雙鏈斷裂，從而誘發細胞的DNA修復機制。在無外源同源片段存在的情況下，則通過非同源末端連接的方式產生小片段 的插入或缺失；在有外源同源片段存在的情況下，則通過同源重組的方式對基因進行糾正或定點插入。

目前豬胚胎干細胞還未成功獲得，而體細胞核移植技術已經成熟，因此，可以先獲得基因敲除的體細胞，然后利用體細胞核移植技術獲得基因敲除豬。成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來，具有分化為動物個體各組織器官的潛能，是一種非常適合用于體細胞核移植技術中的核供體細胞，目前已被廣泛應用。

在生產基因敲除動物的過程中，人們經常會用到標記基因，但是，標記基因可能會促進新耐抗生素病原體的產生或成為新的致敏原，從而引發基因敲除動物的安全性問題。

發明內容

本發明利用pCAG-GFP質粒與針對DJ-1基因設計的TALENs質粒共轉染豬胎兒成纖維細胞，通過多次細胞傳代使pCAG-GFP質粒丟失，并且利用96孔板進行單細胞克隆的篩選，每次可獲得上百個單細胞克隆，通過基因鑒定，可篩選出多個無外源標記基因的DJ-1基因敲除細胞克隆，從而獲得無篩選標記基因的DJ-1基因敲除豬，為研究人類帕金森病提供重要的參考價值。

本發明提供了一種敲除豬DJ-1基因的細胞的構建方法，包括：

1)針對DJ-1基因構建TALENs質粒；

2)用步驟1)得到的TALENs質粒和pCAG-GFP質粒共轉染豬胎兒成纖維細胞；優選地，所述豬胎兒成纖維細胞在共轉染前復蘇并在38.5℃、低氧(5％O₂)、5％CO₂培養箱中培養；

3)將步驟2)共轉染過的豬胎兒成纖維細胞通過分選得到單細胞，所述單細胞經傳代擴繁后，經過鑒定得到DJ-1基因敲除的細胞。

在根據本發明的一個實施方案中，步驟1)所述TALENs質粒是針對DJ-1基因的外顯子2設計的；優選地，所述TALENs質粒的左側TALEN的識別序列為：SEQ ID NO:1：5’-GGAGACGGTTATTCCT-3’，右側TALEN的識別序列為：SEQ ID NO:2：5’-GGAGGACTTACTCCAGCT-3’，中間包含BspHI酶切位點SEQ ID NO:3：GTAGATGTCATGAGACG。在根據本發明的一個實施方案中，步驟2)所述的共轉染豬胎兒成纖維細胞是通過電轉染的方法實現的。

在根據本發明的一個實施方案中，步驟3)所述的分選是通過包括下述步驟的方法實現的：