[發明專利]一種敲除豬DJ-1基因的細胞的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201610078125.5
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN107034192A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 趙建國;姚婧;黃嬌嬌;秦國嵩
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司11280
• 代理人: 李渤,郭廣迅

1.一種敲除豬DJ-1基因的細胞的構建方法，其特征在于，所述方法包括：

1)針對DJ-1基因構建TALENs質粒；

2)用步驟1)得到的TALENs質粒和pCAG-GFP質粒共轉染豬胎兒成纖維細胞；優選地，所述豬胎兒成纖維細胞在共轉染前復蘇并在38.5℃、低氧(5％O₂)、5％CO₂培養箱中培養；

3)將步驟2)共轉染過的豬胎兒成纖維細胞通過分選得到單細胞，所述單細胞經傳代擴繁后，經過鑒定得到DJ-1基因敲除的細胞。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述TALENs質粒是針對DJ-1基因的外顯子2設計的；優選地，所述TALENs質粒的左側TALEN的識別序列為：SEQ ID NO:15’-GGAGACGGTTATTCCT-3’，右側TALEN的識別序列為：SEQ ID NO:25’-GGAGGACTTACTCCAGCT-3’，中間包含BspHI酶切位點SEQ ID NO:3GTAGATGTCATGAGACG。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的分選是通過包括下述步驟的方法實現的：

將共轉染的細胞先用細胞篩篩除細胞團塊后，將細胞懸液移入流式管，在BD-FACSAria流式細胞分選儀中將表達綠色熒光蛋白的細胞單個分選到96孔細胞培養板中，進行細胞培養和鑒定。

4.如權利要求1～3中任一項所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的DJ-1基因敲除的細胞是不含有pCAG-GFP質粒的DJ-1基因敲除的細胞。

5.根據權利要求1～4所述的方法得到的豬DJ-1基因敲除的細胞。

6.一種基于如權利要求5所述的豬DJ-1基因敲除的細胞構建豬DJ-1基因敲除豬的方法，其特征在于，所述構建豬DJ-1基因敲除豬的方法包括：

A)將得到的DJ-1基因敲除細胞進行體細胞核移植和胚胎移植，獲得DJ-1基因敲除豬；

B)通過PCR、酶切和測序的方法鑒定獲得的豬只中DJ-1基因是否被敲除以及GFP基因是否被整合；優選地，利用Western Blot方法鑒定豬只的DJ-1基因是否被敲除。

7.如權利要求6所述的構建豬DJ-1基因敲除豬的方法，其特征在于，步驟A)所述的DJ-1基因敲除豬是通過包括將所述DJ-1基因敲除的細胞與去核的豬成熟卵母細胞結合制備重構胚胎，以及將所述重構胚胎移植到代孕母豬輸卵管內的步驟實現的。

8.如權利要求7所述的構建豬DJ-1基因敲除豬的方法，其特征在于，所述的重構胚胎是通過包括下述步驟的方法實現的：

a)取得成熟卵母細胞，去除成熟卵母細胞的極體和細胞核，得到去除極體和細胞核的卵母細胞；

b)將步驟3)得到的DJ-1基因敲除的細胞注射入步驟a)得到的去除極體和細胞核的卵母細胞的卵周隙中，得到重構胚胎。

c)將步驟b)得到的重構胚胎進行激活，并將激活后的重構胚胎在體外培養液中培養14～16h；優選地，所述重構胚胎的激活是通過電激活實現的。