[發明專利]經血源宮內膜干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 201610077491.9
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105624099A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 陳海佳;王一飛;葛嘯虎;馬巖巖;王小燕
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及干細胞領域，特別涉及經血源宮內膜干細胞的分離培養方法。

背景技術

子宮是一個具有高度再生及分化能力的組織，每個月經周期，女性的子 宮內膜可以從0.5mm左右增長到5～7mm左右，一個女性一生可以經歷400次這 樣的循環。研究表明，子宮內膜中含有干細胞，具有高度的分化潛能，增殖 能力以及較低的免疫源性。但是其直接獲得途徑，包括子宮切除術、早期妊 娠脫膜、刮除術均對供者具有嚴重侵入性。

近年來，日本科學家在女性經血中發現了具有多向分化潛能的干細胞， 該干細胞可用于修復受損的心肌組織。2008年，美國科學家Patel等發現，從 健康女性經血中可分離出來間充質干細胞，這些細胞具有多向分化能力，并 將該細胞命名為經血源子宮內膜干細胞(menstrualblood-derivedmesenchymal stemcells，MenSCs)。MenSCs屬于成體干細胞的一種，具有來源豐富、有效 成分含量豐富、收集過程無創、增殖和分化潛能巨大、無倫理爭論及廢物回 收利用等優點。同時，研究表明，宮內膜干細胞可以用于治療卵巢早衰、子 宮內膜疾病、預防衰老等功能，有望成為較為理想的種子細胞。

目前，對于宮內膜干細胞的分離培養，多采用直接獲得途徑，對患者造 成很大的傷害，同時來源苦難以及受倫理限制等問題；經血源干細胞雖有少 量研究，但是其無簡單方便的方法采集經血，導致經血受污染幾率較高，獲 得的干細胞數量較少，純度較低，分化潛能較低，同時成本較高、過程復雜 等。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種經血源宮內膜干細胞的分離培養方法。本發 明利用經血保存液、隔層離心管和細胞貼壁相結合的方法，達到高效分離培 養經血源宮內膜干細胞的方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了經血源宮內膜干細胞的分離培養方法，包括如下步驟：

步驟1：獲得經血；

步驟2：取所述經血稀釋后獲得經血稀釋液，與分離液混合、離心；

步驟3：收集上清液清洗后，再與培養基混合，離心；

步驟4：收集沉淀，接種，培養。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法步驟2中所述稀釋為 經PBS溶液按照體積比1∶1的比例稀釋；

步驟2中所述分離液為Ficoll分離液，所述經血稀釋液與所述分離液的體 積比為1∶(0.5～1)；

步驟2中所述離心為于700～800g離心15～30min。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法步驟3中所述清洗為 用PBS清洗2～4次；

步驟3中所述培養基為無血清培養基。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法步驟4中所述接種的 密度為(7～8)×10⁵/ml。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法步驟4中所述培養為 48h后半量換液，72h后全量換液，之后每3d換液1次，7～14d在顯微鏡下觀 察到克隆的形成，當細胞生長至70～80％匯合時，胰蛋白酶消化。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法所述胰蛋白酶消化為 棄去培養基，清洗，加質量濃度為0.3～0.5％(w/w)的胰蛋白酶消化，傳代。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法所述消化的時間為2～ 3min，終止消化，離心，用無血清培養基重懸細胞沉淀。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法所述終止消化采用細 胞體積3-5倍量的含5％FBS的培養基；

所述離心為1000rpm離心5min。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法步驟1中獲得的經血 采用經血保存液保存；所述經血保存液包括(2-5)×青霉素、(2-5)×鏈霉素、 30～50μg/ml卡那霉素、30～50μg/ml枸櫞酸鈉、100U/ml肝素鈉的磷酸鹽緩沖 液。

在本發明的一些具體實方案中，所述分離培養方法步驟2所述與分離液 混合和/或步驟3中所述清洗采用隔層離心管。

本發明提供了經血源宮內膜干細胞的分離培養方法，包括如下步驟：獲 得經血；取所述經血稀釋后獲得經血稀釋液，與分離液混合、離心；收集上 清液清洗后，再與培養基混合，離心；收集沉淀，接種，培養。