[發明專利]經血源宮內膜干細胞的分離培養方法在審
| 申請號： | 201610077491.9 | 申請日： | 2016-02-03 |
| 公開（公告）號： | CN105624099A | 公開（公告）日： | 2016-06-01 |
| 發明（設計）人： | 陳海佳;王一飛;葛嘯虎;馬巖巖;王小燕 | 申請（專利權）人： | 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/074 | 分類號： | C12N5/074 |
| 代理公司： | 北京集佳知識產權代理有限公司 11227 | 代理人： | 趙青朵 |
| 地址： | 510000 廣東省廣州市國*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 經血 宮內 干細胞 分離 培養 方法 | ||
1.經血源宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟1：獲得經血；
步驟2：取所述經血稀釋后獲得經血稀釋液，與分離液混合、離心；
步驟3：收集上清液清洗后，再與培養基混合，離心；
步驟4：收集沉淀，接種，培養。
2.根據權利要求1所述的分離培養方法，其特征在于，步驟2中所述稀 釋為經PBS溶液按照體積比1∶1的比例稀釋；
步驟2中所述分離液為Ficoll分離液，所述經血稀釋液與所述分離液的體 積比為1∶(0.5～1)；
步驟2中所述離心為于700～800g離心15～30min。
3.根據權利要求1或2所述的分離培養方法，其特征在于，步驟3中所 述清洗為用PBS清洗2～4次；
步驟3中所述培養基為無血清培養基。
4.根據權利要求1至3任一項所述的分離培養方法，其特征在于，步驟 4中所述接種的密度為(7～8)×105/ml。
5.根據權利要求1至4任一項所述的分離培養方法，其特征在于，步驟 4中所述培養為48h后半量換液，72h后全量換液，之后每3d換液1次，7～14d 在顯微鏡下觀察到克隆的形成，當細胞生長至70～80％匯合時，胰蛋白酶消化。
6.根據權利要求5所述的分離培養方法，其特征在于，所述胰蛋白酶消 化為棄去培養基，清洗，加質量濃度為0.3～0.5％的胰蛋白酶消化，傳代。
7.根據權利要求6所述的分離培養方法，其特征在于，所述消化的時間 為2～3min，終止消化，離心，用無血清培養基重懸細胞沉淀。
8.根據權利要求7所述的分離培養方法，其特征在于，所述終止消化采 用細胞體積3-5倍量的含5％FBS的培養基；
所述離心為1000rpm離心5min。
9.根據權利要求1至8任一項所述的分離培養方法，其特征在于，步驟 1中獲得的經血采用經血保存液保存；所述經血保存液包括(2-5)×青霉素、 (2-5)×鏈霉素、30～50μg/ml卡那霉素、30～50μg/mL枸櫞酸鈉、100U/ml肝 素鈉的磷酸鹽緩沖液。
10.根據權利要求1至9任一項所述的分離培養方法，其特征在于，步 驟2所述與分離液混合和/或步驟3中所述清洗采用隔層離心管。
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