[發明專利]球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法及抗腫瘤應用

在審

• 申請號: 201610076897.5
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105664135A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 劉敏;陳娜;周怡
• 申請（專利權）人: 西安交通大學第一附屬醫院
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61P35/00;C07K14/32;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 王霞

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝 產物的提取方法及抗腫瘤應用。

背景技術

球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus，Bs)，革蘭氏染色呈陽性，是一種末端 有膨大的內生孢子囊的好氧細菌，其菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，并且 閃著油脂樣的光，菌落為白色或淡黃色。球形芽孢桿菌的培養體有營養體期和 芽孢期兩個發育階段，其中二元毒素蛋白在其芽孢期產生。球形芽孢桿菌的細 胞形態在不同發育階段的形態有所不同。營養體期細胞形態為桿狀，周圍有鞭 毛，并且活動活躍。在芽孢期時，由于芽孢的形成使菌體的末端膨大，呈鼓槌 狀突起，待芽孢成熟，伴胞晶體被包在芽胞外膜內。不同的球形芽孢桿菌的芽 孢其形態和大小都不同。在球形芽孢桿菌生長時期，有些菌株會產生伴胞晶體， 有些不產生。伴胞晶體與殺蚊活性相關。所有的球形芽孢桿菌，由于缺乏三羧 酸循環的中間酶導致其不能代謝糖類物質，但是可以利用其它碳化合物作為碳 源。球形芽孢桿菌在40℃生長，生物素、硫胺素等生長因子能促進其生長。

在芽孢形成時期兩個蛋白相互作用折疊組成晶體，單獨表達的BinA和 BinB不能形成伴胞晶體，只能形成無定形包含物。只有BinA蛋白對蚊蟲有毒， 但是毒力比較小。單獨的BinB對蚊蟲無毒，但是能夠增強BinA蛋白的毒力。 只有它們同時存在，才能對蚊蟲有較高的毒性。Western-Blot實驗表明BinA和 BinB蛋白間沒有交叉反應，說明這兩個蛋白之間沒有同源性。一般認為，BinA 決定毒素蛋白的殺蚊活性和特異性，而BinB主要與蚊幼蟲的腸敏感位點特異 性結合。二者同時存在，才能發揮毒素蛋白的殺蚊毒性。

生物毒素是由生物體產生并使其他生物體受到傷害或者致死的物質。生物 毒素不僅具有毒理作用，還具有藥理作用。生物毒素也稱為天然毒素，包括植 物、動物、微生物所產生的有毒物質。根據作用機理，這些毒素分為：細胞溶 解霉素、直接作用于細胞、抑制蛋白質合成、作用于離子通道、作用于細胞骨 架、溶血或凝血的毒素等。生物毒素一般均有抗癌活性，有些生物毒素對腫瘤 細胞具有直接殺傷作用，有些生物毒素抑制腫瘤的血管再生，從而抑制腫瘤生 長。

微生物代謝產物包括毒素，在治療和/或抑制腫瘤或在腫瘤輔助診斷、預 后中有廣泛應用，包含球形芽孢桿菌2317-2的基因重組或組合物及其抗癌作 用等生物活性，及其應用上的基因重組或組合物、相關代謝產物、生物毒素的 抑制/殺滅真菌、細菌、蚊蟲、腫瘤細胞等生物活性及其應用。然而，目前關 于球形芽孢桿菌2317-2的胞外代謝產物的相關抗腫瘤方面的研究未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方 法及抗腫瘤應用，經該提取方法分離純化得到了球形芽孢桿菌2317-2胞外代 謝產物二元毒素晶體蛋白，經證實該二元毒素晶體蛋白能夠有效應用于抗腫瘤 藥物的制備中。

本發明是通過以下技術方案來實現：

本發明公開了一種球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物在制備抗腫瘤藥物 中的應用，所述球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物為二元毒素晶體蛋白。

所述二元毒素晶體蛋白是由等量的41.9kDaBinA和51.4kDaBinB組成。

所述的藥物為抗肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7或乳腺 癌HELA的藥物。

所述的藥物為促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖或抑制腫瘤細胞遷移 的藥物。

本發明還公開了上述的球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法， 包括以下步驟：

1)將球形芽孢桿菌2317-2在LB固體培養基上活化后，接種于LB液體 培養基中，在30℃下震蕩培養過夜；

2)以1:100的比例，將培養過夜的菌液轉接入MBS培養基中，震蕩培養 至芽孢晶體從菌株中完全釋放，收集發酵液，離心取沉淀，將沉淀洗滌后重懸 處理，然后在超聲波處理，直至晶體、芽孢及細胞碎片充分分散，震蕩混勻， 除去泡沫，離心，取沉淀；

3)向沉淀中加水制成懸液，再加入溶菌酶，使懸液中溶菌酶的終濃度為 0.1～0.2mg/ml，然后再37℃處理2～3h，期間每30min取出輕柔混勻數次，然 后離心收集沉淀；