[發明專利]球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法及抗腫瘤應用

在審

• 申請號: 201610076897.5
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105664135A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 劉敏;陳娜;周怡
• 申請（專利權）人: 西安交通大學第一附屬醫院
• 主分類號: A61K38/16
• 分類號: A61K38/16;A61P35/00;C07K14/32;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 王霞

1.球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特 征在于，所述球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物為二元毒素晶體蛋白。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述二元毒素晶體蛋白是由 等量的41.9kDaBinA和51.4kDaBinB組成。

3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述的藥物為抗肝癌7721、 肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7或乳腺癌HELA的藥物。

4.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的藥物為促進腫瘤細胞 凋亡、抑制腫瘤細胞增殖或抑制腫瘤細胞遷移的藥物。

5.如權利要求1所述的球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法， 其特征在于，包括以下步驟：

1)將球形芽孢桿菌2317-2在LB固體培養基上活化后，接種于LB液體 培養基中，在30℃下震蕩培養過夜；

2)以1:100的比例，將培養過夜的菌液轉接入MBS培養基中，震蕩培養 至芽孢晶體從菌株中完全釋放，收集發酵液，離心取沉淀，將沉淀洗滌后重懸 處理，然后在超聲波處理，直至晶體、芽孢及細胞碎片充分分散，震蕩混勻， 除去泡沫，離心，取沉淀；

3)向沉淀中加水制成懸液，再加入溶菌酶，使懸液中溶菌酶的終濃度為 0.1～0.2mg/ml，然后再37℃處理2～3h，期間每30min取出輕柔混勻數次，然 后離心收集沉淀；

4)向沉淀中加入雙蒸水制成懸液，然后加入50mMDTT充分混勻后，于 27℃下靜置1h，離心收集沉淀；

5)將沉淀在-20℃下凍融，加入復方泛影葡胺溶液，混勻后離心，收集上 清液，在無菌水中透析后，低溫真空冷凍制得凍干粉，得到球形芽孢桿菌伴胞 晶體蛋白，4℃保存。

6.根據權利要求5所述的球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法， 其特征在于，步驟2)所述洗滌采用0.5mol/L的NaCl；所述超聲波處理是在4℃， 20kHz，200W的條件下處理25min，期間每破碎5s，停頓5s。

7.根據權利要求5所述的球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法， 其特征在于，步驟4)是按1ml雙蒸水中含有70mg沉淀的量向沉淀中加入雙 蒸水。

8.根據權利要求5所述的球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法， 其特征在于，步驟5)中，加入質量濃度為42％～44％的復方泛影葡胺溶液，透 析時間為24～48h。

9.根據權利要求5所述的球形芽孢桿菌2317-2胞外代謝產物的提取方法， 其特征在于，步驟2)、3)、4)及5)中所述的離心均是在8000～10000r/min 下，離心10～20min。