[發明專利]一種碭山酥梨遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201610076734.7
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105543278B
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 蔡永萍;程曦;金青;李姝妹;張金云;閆沖沖;馬晨輝;程俊;孫寧
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 34148 合肥興東知識產權代理有限公司
• 代理人: 王偉

1.一種碭山酥梨遺傳轉化方法，包括以下步驟：

(1)遺傳轉化受體的建立

以碭山酥梨當年生新梢為外植體，接種在愈傷組織誘導培養基表面誘導培養出愈傷組織，即為遺傳轉化受體；所述愈傷組織誘導培養基配方為：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.2～0.6mg/L+20～30g/L蔗糖+6～7g/L瓊脂+0.1～0.2g/L活性炭，愈傷組織誘導培養基的pH值為5.8～6.0；誘導培養的環境為16小時光照、8小時黑暗光周期培養室，光強1500～2000lx，溫度25℃；

(2)農桿菌的培養及侵染液的配制

將帶有目的基因質粒的農桿菌EHA105在LB固體培養基上劃線活化，再用LB液體培養基培養至OD值達到0.6～0.8，并進行菌液PCR驗證，確保質粒沒有丟失，然后離心收集菌體，用液體愈傷分化培養基懸浮后培養2～3小時，即為侵染液；

(3)侵染與共培養

將愈傷組織浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min條件下侵染10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干多余菌液，然后接種在共培養培養基上培養48～60小時；

所述共培養培養基配方為：1/2MS+6-BA 2.5～3.0mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO₃ 0.5mg/L+AS 0.15mmol/L；共培養溫度25℃，暗培養；

(4)除菌培養與篩選培養

將愈傷組織從共培養培養基中取出，并用含有400mg/L Cef的無菌水進行清洗，然后轉接在除菌培養基上培養3～6天，再轉接至篩選培養基中培養，培養一個月后，存活下來的即為抗性愈傷組織；

(5)抗性愈傷組織GUS染色鑒定

將抗性愈傷組織分成兩份，其中一份用于GUS染色檢測，有藍色顯色反應的抗性愈傷組織認定為陽性愈傷組織，表明碭山酥梨遺傳轉化成功。

2.如權利要求1所述的碭山酥梨遺傳轉化方法，其特征在于：所述外植體選用3月至4月的碭山酥梨當年生新梢。

3.如權利要求1或2所述的碭山酥梨遺傳轉化方法，其特征在于：所述LB固體培養基及LB液體培養基中均附加0.5g/L Kan和0.5g/L Rif；所述液體愈傷分化培養基配方為：1/2MS+6-BA 2.5～3.5mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AS 0.15mmol/L；侵染液通過稀釋控制OD值在0.4～0.5。

4.如權利要求1或2所述的碭山酥梨遺傳轉化方法，其特征在于：所述除菌培養基配方為：1/2MS+6-BA 2.5～3.0mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO₃ 0.5mg/L+Cef350mg/L；除菌培養溫度25℃，無光照。

5.如權利要求1或2所述的碭山酥梨遺傳轉化方法，其特征在于：所述篩選培養基配方為：1/2MS+6-BA 2.5～3.0mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO₃ 0.5mg/L+Cef300mg/L+Hyp3～5mg/L；篩選培養先暗培養10天，再轉入16小時光照、8小時黑暗光周期培養室中培養，光強1500～2000lx，溫度25℃，每20天在相同培養基上繼代一次。