[發(fā)明專利]一種碭山酥梨遺傳轉化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610076734.7
• 申請日: 2016-02-02
• 公開（公告）號: CN105543278B
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發(fā)明（設計）人: 蔡永萍;程曦;金青;李姝妹;張金云;閆沖沖;馬晨輝;程俊;孫寧
• 申請（專利權）人: 安徽農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 34148 合肥興東知識產權代理有限公司
• 代理人: 王偉

本發(fā)明一種碭山酥梨遺傳轉化方法，包括以下步驟：(1)遺傳轉化受體的建立；(2)農桿菌的培養(yǎng)及侵染液的配置；(3)侵染與共培養(yǎng)；(4)除菌培養(yǎng)與篩選培養(yǎng)；(5)抗性愈傷組織GUS染色鑒定。本發(fā)明以碭山酥梨愈傷組織為受體，以NptII為標記基因，以GUS基因為報告基因，通過農桿菌EHA105介導的方法進行碭山酥梨的遺傳轉化，獲得陽性愈傷組織，然后即可通過陽性愈傷組織再分化為試管苗；本發(fā)明首先建立起一種以碭山酥梨當年生新稍為外植體誘導出愈傷組織，進而進行遺傳轉化的方法，碭山酥梨春季新稍酚類物質含量低，而且攜帶病菌量少，接種褐化率和污染率都很低，而且取材方便，愈傷組織誘導率高，能夠滿足遺傳轉化的需求。

技術領域

本發(fā)明涉及園藝作物基因工程領域，具體涉及一種以碭山酥梨愈傷組織為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法。

背景技術

梨屬于薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomaeeae)梨屬(Pyrus L.)植物，是世界上重要的落葉果樹之一。梨的品種可分為東方梨和西洋梨兩大類，東方梨主要栽培于中國、日本和韓國等亞洲國家，包括沙梨(Pyrus pyrifolia)、白梨(Pyrus bretschneideri)和秋子梨(Pyrus ussuriensis)等。梨在中國的栽培面積和產量僅次于柑橘和蘋果，位居第三位，其中原產安徽省碭山縣的碭山酥梨屬白梨系，是我國梨出口的主要品種之一。

梨的童期較長，利用傳統(tǒng)的育種技術選育新的品種需要很長的時間，利用基因工程進行種質改良，將極大的縮短育種進程，加快梨新品種的育種步伐。

隨著分子生物學領域技術迅猛發(fā)展，大量果樹的遺傳轉化技術也在逐步成熟，與其他物種相比梨遺傳轉化起步較晚。于1988年，由Viseur等率先開始了梨屬植物上的轉基因工作，他用梨試管苗葉片作外植體，用帶致瘤質粒的農桿菌(pTiT37)感染轉化，雖然成功誘導出了瘤組織并分化出了不定芽，但最終并未能獲得轉基因植株。此后，各個國家的科學者對梨的遺傳轉化都做了進一步深入的研究，但同國外的研究相比中國關于這方面的研究比國外晚了近10年，而且在現(xiàn)有的報道中，梨遺傳轉化主要集中在西洋梨品種上，東方梨鮮有報道，特別是東方梨中的白梨，因此對白梨系品種碭山酥梨進行轉基因研究十分必要。

目前，梨樹組織培養(yǎng)中所用外植體類型包括莖尖、子葉、花藥、葉柄、葉片和原生質體等，利用這些外植體均可以獲得再生試管苗，但是梨試管苗生根時容易產生大量愈傷組織且生根率低，還會因為根基不夠健壯導致移栽成活率低。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種碭山酥梨遺傳轉化方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：一種碭山酥梨遺傳轉化方法，包括以下步驟：

(1)遺傳轉化受體的建立

以碭山酥梨當年生新稍為外植體，接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基表面誘導培養(yǎng)出愈傷組織，即為遺傳轉化受體；

(2)農桿菌的培養(yǎng)及侵染液的配置

將帶有目的基因質粒的農桿菌EHA105在LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，再用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD值達到0.6～0.8，并進行菌液PCR驗證，確保質粒沒有丟失，然后離心收集菌體，用液體愈傷分化培養(yǎng)基懸浮后培養(yǎng)2～3小時，即為侵染液；

(3)侵染與共培養(yǎng)

將愈傷組織浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min條件下侵染10分鐘，取出后用無菌濾紙吸干多余菌液，然后接種在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～60小時；

(4)除菌培養(yǎng)與篩選培養(yǎng)

將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，并用含有400mg/L Cef的無菌水進行清洗，然后轉接在除菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～6天，再轉接至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)一個月后，存活下來的即為抗性愈傷組織；

(5)抗性愈傷組織GUS染色鑒定