[發(fā)明專利]一種防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610076644.8
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105770892A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙成新;莫小見
• 申請（專利權(quán)）人: 煙臺金海藥業(yè)有限公司
• 主分類號: A61K39/42
• 分類號: A61K39/42;A61P9/00;A61P7/10;A61P1/16;A61P31/20;C07K16/08
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物獸藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸 藥的制備方法。

背景技術(shù)

心包積液-肝炎綜合征（Hydropericardiumhepatitissyndrome,雞心包積液-肝 炎綜合征）,典型癥狀是3-6周齡肉雞突發(fā)發(fā)病，并伴有典型的心包積液和肝炎癥狀，也可見 于肉種雞和蛋雞。研究認(rèn)為，血清4型禽腺病毒（Fowladenovirusserotype4，F(xiàn)AV4）是引 起的本病的病原之一，發(fā)現(xiàn)患病雞肝細(xì)胞內(nèi)有嗜堿性核內(nèi)包涵體，并且肝臟勻漿經(jīng)無菌處 理后，可以復(fù)制出相同的病癥。在電子顯微鏡下從病雞肝中觀察到呈二十面體的病毒，并且 分離到血清型不同的多株腺病毒。但有研究指出，除了FAV4外，有其他因子與本病有關(guān)，這 些因子必須與FAV4共同作用才能復(fù)制出典型癥狀。

2005年12月1日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布“關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知”，金 剛烷胺、金剛乙胺、阿昔洛韋、嗎啉(雙)胍(病毒靈)、利巴韋林等及其鹽、酯的單、復(fù)方制劑 等將不能再作為獸用抗病毒藥物使用。

目前，我國養(yǎng)殖業(yè)對于病毒病的控制，主要以疫苗免疫接種為主。比如新城疫、禽 流感、傳染性支氣管炎等病毒病，均是采取一定的免疫程序來預(yù)防該類疾病的發(fā)生。而一旦 因為免疫抑制或毒株變異等原因?qū)е旅庖呤。瑥亩l(fā)生此類疫病流行的話，則會造成極 大的經(jīng)濟損失。雞心包積液-肝炎綜合征，是我國各地新近流行的一種以FAV4為主要致病原 的“老病”，該病最早在1987年在巴基斯坦流行過。相對于禽流感、新城疫等一類疫病來說， 雞心包積液-肝炎綜合征這些年的發(fā)病情況并不嚴(yán)重，因此，目前也沒有該病的商品疫苗銷 售，更沒有特異性獸用藥能夠防治雞心包積液-肝炎綜合征。然而，從去年3月份山東、江蘇、 遼寧、河南等地陸續(xù)在肉食雞群中流行，部分蛋雞群散發(fā)。發(fā)病肉雞群多于3周齡開始死亡， 4～5周齡達高峰，高峰持續(xù)期4～8天，5～6周齡死亡減少。病程8～15天，死亡率達20～80%， 一般在30%左右。目前臨床治療方案是具有我國特色的保守療法：中獸藥制劑（抗病毒）、保 肝護腎及抗生素（控制繼發(fā)感染）療法。然而，從臨床效果及成本來看，現(xiàn)有的治療方案不僅 治療成本高昂（0.4-0.6元/羽），而且因為這種治療方案的中獸藥抗病毒制劑（比如黃芪多 糖制劑）對雞心包積液-肝炎綜合征不具有針對性，其治療成本高、效果差。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提 供了一種防治雞心包積液-肝炎綜合征的生物獸藥的制備方法，解決目前沒有合適的治療 雞心包積液-肝炎綜合征針對性獸用藥物、現(xiàn)有流行的治療方案成本高、效果差的問題。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種防治雞心包積液-肝炎綜合征 生物獸藥的制備方法，其步驟是：

（1）抗原的制備

A:組織勻漿液的制備：收集病患雞的肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝除表面 的結(jié)締組織的脂肪。剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加1：1-10重量比的冷生 理鹽水，用組織搗碎機10000-15000r/min上下研磨15-30分鐘，制成組織勻漿液；

所述病患雞是指剖檢可見典型雞心包積液-肝炎綜合征癥狀的雞，尤其是指同時可見 心包積液和肝炎癥狀的雞；

所述病患雞的肝臟可以是淋巴組織；

B、凍融、過濾、除菌：組織勻漿液反復(fù)凍融3次后，離心后收集上清液，0.22μm微孔過濾 除菌；

C、增殖：將步驟B所得上清液做5-15倍稀釋，接種10日齡雞胚尿囊腔內(nèi)，每枚雞胚接種 0.2ml，37℃孵化4d后收獲尿囊液；

上述B、C步驟可以是組織勻漿液反復(fù)凍融3次后，加入1倍生理鹽水稀釋混勻，再加入青 鏈霉素雙抗溶液，終濃度為200IU/ml；

可以進一步對第（1）步驟的抗原進行純化，方法是：將收獲尿囊液，盲傳3代，收集尿囊 液，即為純化的病毒抗原；

（2）抗原EID50的測定

將所制得的抗原，一次做10倍稀釋，進行雞胚尿囊腔接種，每個稀釋度接種0.1ml，做9 個重復(fù)，同時設(shè)正常胚對照。置于37℃孵化48小時，棄掉24h內(nèi)死亡胚，收獲24h后死亡胚及 48h活胚的尿囊液，進行HA價的測定。按照Reed-muench方法計算EID50；

（3）制備滅活疫苗