[發明專利]一種防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥的制備方法

在審

• 申請號: 201610076644.8
• 申請日: 2016-02-04
• 公開（公告）號: CN105770892A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 趙成新;莫小見
• 申請（專利權）人: 煙臺金海藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/42
• 分類號: A61K39/42;A61P9/00;A61P7/10;A61P1/16;A61P31/20;C07K16/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥的制備方法，其特征在于，按如下步驟制 得：

（1）抗原的制備

A:組織勻漿液的制備：收集病患雞的肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝除表面 的結締組織的脂肪，剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然后再加1：1-10重量比的冷生 理鹽水，用組織搗碎機10000-15000r/min上下研磨15-30分鐘，制成組織勻漿液；

B、凍融、過濾、除菌：組織勻漿液反復凍融3次后，離心后收集上清液，0.22μm微孔過濾 除菌；

C、增殖：將步驟B所得上清液做5-15倍稀釋，接種10日齡雞胚尿囊腔內，每枚雞胚接種 0.2ml，37℃孵化4d后收獲尿囊液；

（2）抗原EID50的測定

將所制得的抗原，一次做10倍稀釋，進行雞胚尿囊腔接種，每個稀釋度接種0.1ml，做9 個重復，同時設正常胚對照，置于37℃孵化48小時，棄掉24h內死亡胚，收獲24h后死亡胚及 48h活胚的尿囊液，進行HA價的測定，按照Reed-muench方法計算EID50；

（3）制備滅活疫苗

將所制得尿囊液，用生理鹽水稀釋至10^-5-10^-10EID50/0.1ml，用終濃度為0.3的甲醛在 37℃下滅活24h，即為制苗用抗原，把抗原乳化制成油乳劑滅活疫苗，并進行滅活疫苗的安 全檢驗；

（4）產蛋雞的免疫

選取30周齡的健康產蛋雞，用安全檢驗合格的滅活疫苗進行免疫，免疫程序為：

第一次免疫：每只雞頸部皮下注射0.2ml；

第二次免疫：2周后，每只雞頸部皮下注射0.4ml；

第三次免疫：2周后，每只雞頸部皮下注射1ml；

（5）高免蛋的收集

產蛋雞第三次免疫后10-14天，開始抽樣測定高免雞蛋蛋黃中抗雞心包積液-肝炎綜合 征卵黃抗體效價，蛋黃與1.8%濃度的鹽水按照體積比1：1稀釋，然后按照體積比1：1加入6- 8%的PEG6000溶液，保證溶液的鹽濃度為0.9%、PEG6000濃度為3-4%，攪拌均勻后，常溫放置 1-2小時，然后3000rpm離線15-20分鐘，取清液，測定HI效價，HI效價≥6即為合格，之后收集 雞蛋；

（6）提取抗雞心包積液-肝炎綜合征卵黃抗體

A、雞蛋消毒：將雞蛋清洗干凈，然后，浸入37-40℃的消毒液中消毒15-20分鐘，取出晾 干備用；

B、分離蛋黃：將已消毒晾干的雞蛋打破后，充分去除蛋清、系帶，收集蛋黃；

C、提取抗體：將蛋黃液與同體積PBS溶液混合后攪拌均勻，然后用6-8%的PEG6000溶液 對混合液進行體積比1：1的混合均勻，然后靜置2-3小時，然后3000rpm離心15-20分鐘，收集 上清液；

D、加入滅活劑和穩定劑：上清液按終濃度體積比為0.05%加入甲醛，充分攪拌混合，密 封1-2小時后加入終濃度重量比0.02%的穩定劑吐溫-20，混合均勻；

E、過濾除菌：用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得到抗雞心包積液-肝炎綜合征卵黃抗體 生物制劑藥物，主要成分為卵黃抗體；

F、安全檢驗，形成產品：用3只20g的小白鼠做安全性檢驗，每只小白鼠腹腔注射0.5ml 步驟E所得抗體液，觀察7天，無任何異常反應為合格。

2.根據權利要求1所述的防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥的制備方法，其特征在 于，所述病患雞的肝臟可以是淋巴組織。

3.根據權利要求1所述的防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥的制備方法，其特征在 于，所述病患雞是指剖檢可見典型雞心包積液-肝炎綜合征癥狀的雞，尤其是指同時可見心 包積液和肝炎癥狀的雞。

4.根據權利要求1所述的防治雞心包積液-肝炎綜合征生物獸藥的制備方法，其特征在 于，第（1）步驟中的B、C步驟可以是組織勻漿液反復凍融3次后，加入1倍生理鹽水稀釋混勻， 再加入青鏈霉素雙抗溶液，終濃度為200IU/ml。