[發(fā)明專利]制備候選測序探針集的方法、裝置及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610075006.4
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN107034267B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐訊;蔣慧;耿春雨;范廣益;梁恩靖;祝珍珍
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/11;C40B40/06;C12M1/34;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發(fā)明公開了制備候選測序探針集的方法、裝置及其應(yīng)用，其中，制備候選測序探針集的方法包括：(1)基于參考基因組的目標mRNA序列設(shè)計探針，構(gòu)建候選探針集合；(2)將候選探針集合與參考基因組的目標mRNA序列進行比對；(3)基于比對結(jié)果，對候選探針集合中的所有候選探針進行篩選；(4)針對參考基因組目標mRNA中的高度同源基因設(shè)計得到相同的探針；(5)合并特異性探針集和針對高度同源基因的探針。利用該方法能夠有效地獲得針對參考基因組全部mRNA的候選測序探針集，進而，基于其能夠有效制備獲得轉(zhuǎn)錄組文庫特異性測序引物組，利用該測序引物組進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果及確定的轉(zhuǎn)錄本序列準確可靠、數(shù)據(jù)偏向性低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)錄組文庫測序分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及制備候選測序探針集的方法、裝置及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，轉(zhuǎn)錄組建庫及測序領(lǐng)域可以基于短的雙末端配對的讀長序列進行全轉(zhuǎn)錄組的信息分析，包括了可變剪接等遺傳表達事件的分析。然而，目前的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，獲得的測序結(jié)果準確性低，數(shù)據(jù)偏向性高，后續(xù)無法將較為復(fù)雜的遺傳信息進行解碼注釋，轉(zhuǎn)錄本和可變剪切分析難。

因而，目前的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)仍有待改進。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種測序結(jié)果準確可靠、數(shù)據(jù)偏向性低，且能夠有效檢測獲得新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪切形式的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

基因測序發(fā)展到第二代高通量測序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄組建庫及測序領(lǐng)域可以基于短的雙末端配對的讀長序列進行全轉(zhuǎn)錄組的信息分析，包括了可變剪接等遺傳表達事件的分析，而由于較短的讀長限制(50/90nt*2的堿基)使得轉(zhuǎn)錄組的分析無法將較為復(fù)雜的遺傳信息進行解碼注釋。第三代單分子測序的技術(shù)達到幾十kb級別的讀長使得基因測序及后續(xù)分析軟件不再受到短序列讀長對數(shù)據(jù)分析的限制，然而第三代測序技術(shù)當前由于測序準確性只能達到85％的水平，從而使得該技術(shù)也無法快速應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組等領(lǐng)域的測序。同時當前轉(zhuǎn)錄組建庫技術(shù)需要經(jīng)過核糖體去除、一鏈反轉(zhuǎn)錄、二鏈cDNA合成、全長cDNA打斷、標準DNA建庫等繁瑣步驟，對總RNA的起始量要求較高，且繁瑣的操作過程帶來了數(shù)據(jù)的偏向性。

而發(fā)明人在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，通過對RNA數(shù)據(jù)的分析選擇合適的測序引物組，通過不同的毗鄰測序引物組進行幾乎全長的RNA測序，進而通過測序得到的短讀長進行連續(xù)較長讀長的組合，能夠更好地實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果及確定的轉(zhuǎn)錄本序列準確可靠、數(shù)據(jù)偏向性低，有利于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄本和可變剪切分析，且能夠有效檢測獲得新的新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪切形式。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種制備候選測序探針集的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：

(1)基于參考基因組的目標mRNA序列，以20bp為窗口，10bp為步長設(shè)計探針，構(gòu)建候選探針集合；

(2)將所述候選探針集合中的所有候選探針與所述參考基因組的目標mRNA序列進行比對，以便獲得比對結(jié)果；

(3)基于所述比對結(jié)果，對所述候選探針集合中的所有候選探針進行篩選，以便得到特異性探針集，其中所述篩選包括：去除比對到除自身以外的mRNA的位置且連續(xù)比對上的長度大于10bp且錯配小于等于2的候選探針；

(4)針對所述參考基因組目標mRNA中的高度同源基因，按照步驟(1)的方法設(shè)計得到相同的探針，以便得到針對高度同源基因的探針；

(5)合并所述特異性探針集和所述針對高度同源基因的探針，以便獲得所述候選測序探針集。