[發(fā)明專利]制備候選測序探針集的方法、裝置及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610075006.4
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN107034267B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 徐訊;蔣慧;耿春雨;范廣益;梁恩靖;祝珍珍
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/11;C40B40/06;C12M1/34;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種確定待測樣品轉錄組文庫的目標mRNA序列的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提供待測樣品的基因組轉錄組文庫，所述基因組轉錄組文庫的插入片段長度為X；

制備獲得N個參考基因組目標mRNA特異性的測序引物組，包括；

(1)基于參考基因組的目標mRNA序列，以20bp為窗口，10bp為步長設計探針，構建候選探針集合；

(2)將所述候選探針集合中的所有候選探針與所述參考基因組的目標mRNA序列進行比對，以便獲得比對結果；

(3)基于所述比對結果，對所述候選探針集合中的所有候選探針進行篩選，以便得到特異性探針集，其中所述篩選包括：去除比對到除自身以外的mRNA的位置且連續(xù)比對上的長度大于10bp且錯配小于等于2的候選探針；

(4)針對所述參考基因組目標mRNA中的高度同源基因，按照步驟(1)的方法設計得到相同的探針，以便得到針對高度同源基因的探針；

(5)合并所述特異性探針集和所述針對高度同源基因的探針，以便獲得所述候選測序探針集；針對所述參考基因組目標mRNA中的每一個mRNA，均單獨按照待測樣品基因組轉錄組文庫的插入片段長度X進行區(qū)域劃分，每一個插入片段長度大小的區(qū)域作為一組，剩余不足插入片段長度大小的區(qū)域也視為一組，以便將所述參考基因組的目標mRNA分為M組，且基于各組在所述參考基因組上的位置順序，將各組依次命名為第1組、第2組……第M組；

基于所述轉錄組文庫的插入片段長度X和測序讀長Y，確定每一組設置的測序探針數目N，其中N≈X/Y，X＝200，Y＝50，N＝4；

基于所述待測樣品的候選測序探針集，在每一組均優(yōu)選出N個最優(yōu)探針作為測序探針，其中每一組的所述N個測序探針在參考基因組上的位置相鄰，針對每一組的N個最優(yōu)探針，使每相鄰的兩個最優(yōu)探針之間的距離為測序讀長；以及當優(yōu)選位置的探針為非特異性的探針時，重新在該優(yōu)選位置的上下游10nt的位置進行探針選擇，篩選最優(yōu)探針；且依據各測序探針在參考基因組上的位置順序，分別將每一組的測序探針以“組號-組中探針順序號”進行命名，其中，第M組的測序探針依次為M-1、M-2……M-N；以及

分別合并各組中探針順序號相同的測序探針，以便獲得N個參考基因組目標mRNA特異性的測序引物組，其中，第N組測序引物組中的測序探針為1-N、2-N……M-N；

利用所述N個參考基因組目標MRNA特異性的測序引物組對所述待測樣品的基因組轉錄組文庫進行梯度測序，以便獲得N組測序結果，其中，所述梯度測序包括N個測序循環(huán)，依次利用第1組至第N組測序引物組進行測序；以及

基于每個測序引物組的測序探針的序列以及相應的測序結果，確定所述待測樣品的基因組轉錄組文庫的目標mRNA的序列；

所述參考基因組和所述待測樣品為同一物種。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因組轉錄組文庫由以單鏈環(huán)狀DNA形式存在的插入片段構成。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述參考基因組為人參考基因組。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在進行所述梯度測序之前，進一步包括：

將所述基因組轉錄組文庫中的單鏈環(huán)狀DNA制備成DNA納米球。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，基于每個測序引物組的測序探針的序列以及相應的測序結果，確定所述待測樣品的基因組轉錄組文庫的目標mRNA的序列，進一步包括：

基于測序探針序列的來源和在參考基因組上的位置順序，確定測序結果中測序序列的來源；

基于所述測序結果中測序序列的來源，組裝獲得轉錄本序列，所述轉錄本序列即為目標mRNA序列。